可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用。本发明专利技术提供了使用可共价结合底物的标签融合蛋白通过变性剂纯化方式在CLIP技术中的应用。本发明专利技术使用可共价结合底物的标签的融合蛋白通过蛋白变性试剂洗涤的方式得到可以用于测序的RNA文库，结果证明可以很好地重复以前的文献发表的实验结果。在操作上省略了传统CLIP步骤中需要通过转膜并且切胶回收片段的步骤。该方法通过可共价结合底物的标可和固定于介质上的特异性结合物形成共价键的特性，将传统上不能在磁珠上直接进行的剧烈洗涤方法加入到实验操作步骤中。这样在操作上比较简便，节省了操作时间，优化了CLIP步骤，减少了操作过程中可能会造成的损失。

The application of a covalent binding substrate to the label protein in CLIP

The invention discloses the application of a covalently binding substrate to the label protein in CLIP. The present invention provides the application of the label fusion protein that uses covalent binding substrates in the CLIP technology by denaturant purification. The RNA library can be used for sequencing by using the fusion protein of covalently bound substrate label, which is washed by protein denaturing reagent. The result proves that it can well repeat the experimental results published before. In operation, the steps in the traditional CLIP step are omitted. Through the covalently bonded characteristics of covalently bound substrates and specific conjugates on the medium, the method of severe washing which is not directly carried on magnetic beads is added to the experimental operation steps. This is easy to operate, saves the operation time, optimizes the CLIP steps, and reduces the loss that may be caused during the operation.

【技术实现步骤摘要】
可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用
本专利技术属于RNA生物学以及分子生物学领域，涉及一种可共价结合底物的标签蛋白在进行CLIP(cross-linkingimmunoprecipitation，紫外交联免疫共沉淀)实验中的应用，具体涉及CLIP技术中，使用带有可共价结合底物的标签的融合蛋白，通过变性试剂洗涤的方式纯化蛋白-RNA共价交联复合物，从而省略了SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺)电泳、醋酸纤维素转膜或同位素标记等步骤，最终得到可以用于测序的cDNA文库。
技术介绍
研究RNA结合蛋白和其结合的RNA的分子生物学方法，简而言之，就是通过纯化RNA和RNA结合蛋白的复合物。纯化复合物的方法既可以是沉淀RNA，也可以是沉淀RNA结合蛋白。由于沉淀RNA的技术有其局限性，因此科研人员更多的通过沉淀RNA结合蛋白的方法，获得RNA和RNA结合蛋白质的复合物。最初，RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)技术被科研人员广泛运用到研究RNA和蛋白质的互作领域。RIP技术首先通过针对靶蛋白的抗体把组织或细胞内的相应的RNA和RNA结合蛋白的复合物沉淀下来。然后经过纯化和分离得到RNA，并通过下游的分析技术得到RNA的信息。RIP技术与ChIP技术的总体思路类似，但是由于研究的对象不同。其相关的步骤有很多变化。而且RNA在体外容易降解，所以对于RNA的操作和实验使用的试剂有更高的要求。RIP技术与microarray技术相结合，就成了RIP-Chip技术；与高通量测序技术相结合就成了RIP-seq技术。RIP技术由于对蛋白和核酸复合物的洗涤比较温和，所以有一定的局限性。在RIP的数据中假阳性的结果比较多，而且也无法得知RNA和蛋白的具体结合位点信息【参见Jayaseelan,S.,F.Doyle,andS.A.Tenenbaum,Profilingpost-transcriptionallynetworkedmRNAsubsetsusingRIP-ChipandRIP-Seq.Methods,2014.67(1):p.13-9.】。2003年，Darnell实验室最先发表了通过紫外交联的方法来研究RNA和蛋白质互作的相关文章。最初的CLIP实验步骤结合了RIP和ChIP的实验步骤。在RNA和RNA蛋白复合物进行免疫沉淀之前，运用了研究DNA和蛋白互作的方法，即紫外交联。由于当时技术的局限性，他们无法运用高通量测序技术，因此获得的数据有限。即使如此，他们运用CLIP技术在小鼠的脑组织中鉴定出了神经特异的RNA结合蛋白和剪切因子NOVA1和NOVA2的RNA结合位点【参见Ule,J.,etal.,CLIPidentifiesNova-regulatedRNAnetworksinthebrain.Science,2003.302(5648):p.1212-5.】。CLIP所得到的结论通过在小鼠脑组织中敲除相关基因而得到验证。2005年，他们采用高通量测序技术，又对CLIP获得的文库进行了深度测序，并根据测序的结果初步绘制了Nova蛋白的全基因组蛋白和RNA的互作网络。他们将CLIP和高通量测序相结合的技术称为HITS-CLIP技术【参见Ule,J.,etal.,Novaregulatesbrain-specificsplicingtoshapethesynapse.NatGenet,2005.37(8):p.844-52.】。同一时期，又有课题组运用CLIP和高通量测序技术相结合研究了RbFox2蛋白的全基因组RNA与蛋白互作网络，并且将其命名为CLIP-seq【参见Yeo,G.W.,etal.,AnRNAcodefortheFOX2splicingregulatorrevealedbymappingRNA-proteininteractionsinstemcells.NatStructMolBiol,2009.16(2):p.130-7.】。从此以后高通量测序技术越来越多地被运用到RNA和蛋白全基因组互作网络的研究。2009年，Darnell实验室对Ago2蛋白结合的miRNA-mRNA的互作通过CLIP-seq技术进行了解析，获得了miRNA-mRNA的之间互作的全基因组信息【参见Chi,S.W.,etal.,ArgonauteHITS-CLIPdecodesmicroRNA-mRNAinteractionmaps.Nature,2009.460(7254):p.479-86.】。同年，Xue,Y等人通过CLIP技术对PTB蛋白在核内对mRNA前体进行可变剪切的机制进行了研究【参见Xue,Y.,etal.,Genome-wideanalysisofPTB-RNAinteractionsrevealsastrategyusedbythegeneralsplicingrepressortomodulateexoninclusionorskipping.MolCell,2009.36(6):p.996-1006.】。CLIP技术相比RIP技术有了一些改进。首先，无论是细胞样品，还是组织样品，都需要通过紫外线照射处理。通过紫外照射，RNA和蛋白质之间会形成共价键。打开共价键需要的能量很高，因此蛋白和RNA的复合体可以经受住强烈的纯化过程。因此，紫外线的使用可以提高测序得到数据的信噪比。同时，与ChIP中使用的福尔马林(甲醛)交联相比，UV交联不会引起大分子和多分子之间化学桥键的形成，干扰信噪比。UV交联只在几个埃的距离内进行交联，即只会把蛋白质和互作核酸之间进行交联，形成共价键。其次，在CLIP的操作步骤中引入了RNA酶的消化。因为没有被蛋白保护的RNA会被或者更容易被RNA酶进行消化，温和的RNA酶消化反应可以将没有结合蛋白的RNA部分给降解掉，只保留蛋白结合的RNA部分。截短后的RNA更容易被进行转录和测序以及进行结构域分析，另外也避免了沉淀不必要的蛋白质RNA蛋白复合体。正因为如此，后来的RIP操作步骤中也加入了这一步核酸酶的处理。已有文献报道的RNA消化酶有RNaseA，RNaseT1，RNaseI等。他们的应用各有好处和缺点。虽然复合物中RNA被截短了，但是因为在后续的纯化过程中没有去除RNA酶的步骤，所以对结果会有一定的干扰。最后，CLIP的样品可以经受住剧烈条件下的洗涤。例如PBST的多次洗涤，SDS-PAGE胶纯化，转膜到醋酸纤维素薄膜上等。这些步骤都可以去除非特异性地结合在抗体上的蛋白质，同时可以减少没有结合和没有交联的RNA，减少数据的背景。CLIP技术是基于ChIP和RIP技术发展而来。传统CLIP的技术如下：在细胞培养之后，通过紫外光照射使蛋白和RNA进行交联。裂解细胞后，对复合物进行RNA酶处理，使蛋白质没有保护的RNA部分进行降解，并将RNA的长度修剪到趋于一致。接着通过特异性的抗体在体外免疫沉淀蛋白质，将RNA和蛋白质的复合物沉淀下来。温和洗涤后，在RNA的3’末端加上RNA接头。在RNA的5’末端标记上同位素32P。然后将蛋白质和RNA复合物变性后跑SDS-PAGE胶，并且转膜到硝酸纤维素薄膜上。因为硝酸纤维素薄膜的特点是只能结合蛋白质，而不能结合RNA。转膜后通过显本文档来自技高网...

【技术保护点】
可共价结合底物的标签蛋白在紫外交联免疫共沉淀技术中的应用。

【技术特征摘要】
1.可共价结合底物的标签蛋白在紫外交联免疫共沉淀技术中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述可共价结合底物的标签蛋白作为紫外交联免疫共沉淀技术中靶蛋白的融合标签使用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用为用于研究RNA与RNA结合蛋白的相互作用，紫外交联免疫共沉淀技术中用非跑胶非转膜的方式纯化RNA-蛋白复合物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将由所述可共价结合底物的标签蛋白和所述靶蛋白形成的融合蛋白通过共价键与带有介质的所述可共价结合底物的标签蛋白的特异性结合物相连，然后通过蛋白质变性洗涤的方式纯化所述RNA-蛋白复合物。5.一种使用可共价结合底物的标签蛋白并通过非胶纯化方式进行紫外交联免疫共沉淀获取RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，包括如下步骤：(1)使受体细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白是由连接肽将可共价结合底物的标签蛋白和靶蛋白连接而形成的融合蛋白；(2)对步骤(1)中表达了所述融合蛋白的受体细胞进行紫外照射，使RNA-蛋白复合物中的RNA与蛋白之间形成共价键而交联，收集细胞样本；(3)对步骤(2)所收集的细胞样本进行裂解，然后通过连接有所述可共价结合底物的标签蛋白的特异性结合物的介质进行免疫沉淀，获得含有“靶标RNA-融合蛋白-介质”的沉淀样本；(4)对步骤(3)所得的沉淀样本进行非变性洗涤，然后再进行去磷酸化处理；(5)对步骤(4)处理后的样本进行变性洗涤；(6)对步骤(5)处理后的样本用能够特异性识别所述连接肽的蛋白酶进行酶切处理，从而将由所述靶蛋白和所述靶标RNA形成的RNA-蛋白复合物从所述介质上分离下来；(7)将步骤(6)所得的由所述靶蛋白和所述靶标RNA形成的RNA-蛋白复合物中的所述靶蛋白去除，从而获得所述靶标RNA。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述非变性洗涤为：用含有0.1％TritonX-100和500mMNaCl的PBS缓冲液洗涤2次；用含有0.1％TritonX-100的PBS缓冲液洗涤3次；其中％表示体积百分含量；和/或步骤(5)中，所述变性洗涤为两次变性洗涤；...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞洋，顾嘉琦，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11