Ｐｏｎｔｉｎ５２作为ＳＵＭＯ化底物蛋白的应用、ＳＵＭＯ化的Ｐｏｎｔｉｎ５２蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了蛋白Ｐｏｎｔｉｎ５２的应用以及ＳＵＭＯ化的Ｐｏｎｔｉｎ５２蛋白及其应用。本发明专利技术提供的蛋白Ｐｏｎｔｉｎ５２可作为ＳＵＭＯ化底物蛋白，ＳＵＭＯ化的Ｐｏｎｔｉｎ５２蛋白可作为药物靶点。本发明专利技术提供的蛋白Ｐｏｎｔｉｎ５２可用作ＳＵＭＯ化底物，以制备ＳＵＭＯ化的Ｐｏｎｔｉｎ５２蛋白。同时，由于Ｗｎｔ信号通路与生物个体的发育以及许多癌症的发生发展有很大的关系，因此，ＳＵＭＯ化的Ｐｏｎｔｉｎ５２可以作为一个很好的药物靶点。利用小分子化学药物或者其它蛋白质因子影响或者改变Ｐｏｎｔｉｎ５２正常的ＳＵＭＯ化，从而能影响Ｗｎｔ信号通路的传递，因而能够影响生物个体的发育和癌症的发生发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶学领域，具体地说，涉及蛋白p0ntin52作为SUMO化底物蛋白的应 用、SUMO化的Pontin52蛋白及其应用。
技术介绍
SUMO (small ubiquitin-related modifier)是类泛素蛋白家族的重要成员之一， 可通过SUMO的C端羧基与靶蛋白的赖氨酸ε氨基形成异肽键而结合，以发挥相应的功能， 例如，SUMO化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性及信号转导等多种细胞内活 动，因此，SUMO化是一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式。因此，确定某种蛋白能否被SUMO化修饰，对该蛋白功能的研究具有重要意义。现有研究表明，可SUMO化修饰的底物靶蛋白上通常存在一个ΨKxE motif (其中， Ψ表示大的疏水氨基酸残基，X表示任何氨基酸残基)，但研究发现存在ΨΚχΕ motif的蛋 白并不一定都能作为SUMO化底物蛋白，从而导致发现能用于SUMO化的底物蛋白的困难。蛋白P0ntin52是一种Wnt信号通路中的一种重要蛋白，在Wnt信号通路中发挥重 要作用，但未曾报道过其能被用作SUMO化修饰的底物靶蛋白，也没有SUMO化的P0ntin52 蛋白的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种蛋白P0ntin52的应用。本专利技术还有一个目的在于，提供一种P0ntin52蛋白。本专利技术还有一个目的在于，提供SUMO化的P0ntin52蛋白的应用。本专利技术提供的蛋白P0ntin52的应用为蛋白Pontin52作为SUMO化底物蛋白的应用。本专利技术提供的Pontin52蛋白为SUMO化的Pontin52蛋白。本专利技术提供的SUMO化的P0ntin52蛋白的应用为作为药物靶点的应用。本专利技术发现并证实了 Wnt信号通路中的蛋白Pontin52可被SUMO化，即蛋白 Pontin52可用作SUMO化底物，以制备SUMO化的Pontin52蛋白。同时，由于Wnt信号通路与 生物个体的发育以及许多癌症的发生发展有很大的关系，因此，SUMO化的P0ntin52可以作 为一个很好的药物靶点。利用小分子化学药物或者其它蛋白质因子影响或者改变Pontin52 正常的SUMO化，从而能影响Wnt信号通路的传递，因而能够影响生物个体的发育和癌症的 发生发展。附图说明图1为Pontin52，Reptin52, Pygo，Sox 17蛋白体外SUMO化处理的蛋白电泳检测 结果，其中，泳道1为未加入蛋白的空白对照的检测结果，泳道2为没有经过37°C反应的阴性对照的检测结果，泳道3-5为蛋白浓度依次提高的反应体系的检测结果。图 2 为 Pontin52 蛋白中 K7，K107, K171, K268 分别突变为 R7, R107, R171, R268 后，进行体外SUMO化处理的蛋白电泳检测结果。图3为P0ntin52蛋白细胞内SUMO化的蛋白电泳检测结果。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实 验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。在本专利技术的下述实施例中，对Wnt信号通路中蛋白质分子的序列进行分析的方法 如下首先分析蛋白质的一级结构，即蛋白质的氨基酸序列，然后利用SUMOylation Sites Prediction (SUMOsp)系统(Xue et.al, SUMOsp a web server for sumoylation site prediction. Nucleic Acids Research，2006，Vol. 34，254)对氨基酸序列进行分析， 找出潜在的被SUMO化的氨基酸序列，再与传统的SUMO化序列(Ψ-Κ-Χ-Ε/D)对比分析，以 预测其是否能被SUMO化。在本专利技术的下述实施例中，使用的大肠杆菌DH5 α和BL2菌种获自Invitrogen，质 粒pET28a购自Novagen公司，哺乳动物细胞株HEK293T购自ATCC，用于哺乳动物细胞中表 达的质粒载体为PM02R. χ (GeneCopoeia公司)，质粒Lacz购自GeneCopoeia公司，293T细 胞购自ATCC，质粒M02购自GeneCopoeia公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒购 自 Qiagen 公司，SuperScript III 试剂盒购自 Invitrogen 公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的溶液配方如下SUMO 化反应体系50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 2mM DTT,5mMATP, IOmM MgCl2, His-SAE I (200ng)，His-SAE II (600ng)，His_UBC9 (500ng)和 His-SUMOl (氨基酸残基 1-97，1 μ g)。细胞裂解液20mMTris-HCl, 150mM NaCl 禾口 1 % ν/ν Triton Χ—100，pH 7.5， Protein Inhibitor(购自 Roche)，IOmM NEM(购自 Sigma)。本申请的专利技术人在对Wnt信号通路中蛋白质分子进行研究时，发现其中有4个蛋 白(Pontin52，R印tin52，Soxl7和Pygo)的氨基酸序列中具有Ψ-Κ-Χ-Ε/D类似序列，即在 上述蛋白的氨基酸中可能存在可被SUMO化修饰的位点，然后通过体外试验和细胞内试验， 确定了蛋白Pontin52可被用作SUMO化修饰的底物，同时还通过点突变确定了 Pontin52上 SUMO化的位点，具体过程如实施例所示。实施例1、Wnt信号通路中可能用作SUMO化的蛋白质底物预测对Wnt信号通路中蛋白质分子的序列进行分析，结果显示，Wnt信号通路中的 蛋白Pontin52、R印tin52、Sox 17和Pygo均有Ψ-K-X-E/D类似序列，因而有可能可作 为SUMO化修饰的底物，其中的类似序列为以下序列P0ntin52 (VK7ST，IK107KT, KK108TE, LK171LD, KK268TE)，Reptin52 (SK115TE, IK132EE, IK269SE, LK456GE)，Soxl7 (VK45GE, AK63GE, AK80DE)，Pygo (KK38KR, PK238QD)。为确定上述4种蛋白是否能作为SUMO化修饰的底物，专利技术人随后进行了体外SUMO 化实验，并将在体外SUMO化实验中确认为可被SUMO化的蛋白P0ntin52进行了突变，确定 了其SUMO化位点，同时还进行了细胞内SUMO化实验验证，以确定其能否在体内SUMO化。实施例2、体外SUMO化实验验证首先构建了质粒SAEI-pET28a，SAEII_pET28a，Ubc9_pET28a 和 SUM01_pET28a，然 后，分别转化到原核细胞Ε. coli BL21(DE3)中表达，并借助表达出的蛋白质上的6His序列 与Ni亲和柱可逆结合的特性来纯化获得SAEI，SAEII，Ubc9本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白Ｐｏｎｔｉｎ５２作为ＳＵＭＯ化底物蛋白的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨淑伟，王凯，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]