一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR‑RFLP鉴定方法技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，公开了一种岩牡蛎与长牡蛎PCR‑RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的COI引物。分别利用16S rRNA通用引物与此COI引物扩增两种牡蛎的16S rRNA与COI基因片段，并对扩增出的目的基因片段进行测序，通过对测序结果进行限制性内切酶特异性位点分析，最终选取同一种限制性核酸内切酶

A rock oysters and oyster mitochondrial PCR RFLP identification method

The invention relates to the field of molecular biology technology, discloses a rock oysters and oyster PCR RFLP identification method and identification for a pair of COI primers. 16S rRNA and COI gene fragments respectively using 16S rRNA primers with the COI primers amplified two oysters, and sequencing of target gene fragment was amplified and analyzed by restriction endonuclease specific sites on the sequencing results, the final selection with a restriction endonuclease

【技术实现步骤摘要】
一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR-RFLP鉴定方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR-RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的线粒体COI基因引物。
技术介绍
牡蛎（Ostreidae）是世界性广布种类，是世界各国海水养殖业重要的养殖对象，也是目前我国乃至世界产量最大的经济贝类。2016年中国牡蛎养殖产量达483万t，居世界首位。巨蛎属牡蛎是我国重要的经济种类，常见的种类主要有长牡蛎（Crassostreagigas），近江牡蛎（Crassostreaariakensis），香港巨牡蛎（Crassostreahongkongensis），葡萄牙牡蛎（Crassostreaangulata），以及熊本牡蛎（Crassostreasikamea）。其中，长牡蛎亦称太平洋牡蛎，是我国北方沿海最主要的养殖种类。长牡蛎的繁殖期在每年的6月至9月，此时体内糖原含量已逐渐消耗，口感较差，不宜供应市场。因此，急需引进优良牡蛎新品种来供应夏季市场。岩牡蛎（Crassostreanippona）又称夏牡蛎，属软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、珍珠贝目（Pterioida）、牡蛎科（Ostreidae），主要分布在日本、韩国等东亚地区，具有抗病能力强、适应范围广、生长速度快、产量高等特点。岩牡蛎产卵期在8-9月，且有多批次放精产卵的特点，夏季体内糖原含量仍保持在较高水平，味道较好，弥补了长牡蛎夏季产卵不能上市的空缺，深受市场欢迎。为了丰富我国牡蛎的养殖种类，我们从日本引进岩牡蛎进行人工育苗和养殖试验。在引种繁育中发现，岩牡蛎与长牡蛎成体区别明显，但稚贝不易区分。由于牡蛎的外壳可塑性较强和分布区域的重叠性，仅仅依据外部形态学特征鉴定牡蛎种类存在很强的主观因素，这给岩牡蛎养殖新品种的开发带来极大困难。因此，迫切需要一种快速有效的鉴别岩牡蛎与长牡蛎的技术方法。聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）技术是一种常用的快速简便分析物种组成的方法，与PCR产物测序的序列对比鉴定方法相比，其简单易行、周期短、费用低，已广泛应用于水产动物的物种鉴定，成为实际应用中常用的分子生物学物种鉴定手段。基于上述情况，专利技术一种岩牡蛎与长牡蛎快速PCR-RFLP鉴定技术具有现实紧迫性。该PCR-RFLP技术将会为岩牡蛎与长牡蛎的物种鉴定、养殖开发与科学研究提供技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体DNAPCR-RFLP鉴定方法，并提供一对用于区分岩牡蛎和长牡蛎的扩增引物。为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：登陆美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）的DNA序列数据库（GenBank）下载岩牡蛎与长牡蛎线粒体COI序列。将下载线粒体COI序列利用Mega6.0软件进行比对分析，确定序列两端保守区域；使用引物设计软件PrimerPremier5在两种牡蛎COI序列的相对保守区域设计引物，并合成。所设计的COI引物为：COIY-F:5'-CTATTAGAAATATGCGGTCTG-3',COIY-R:5'-AACAAAGTAAGTATCGTGAAG-3'。提取岩牡蛎与长牡蛎DNA，与设计的COI引物和16SrRNA通用引物在以下反应体系下进行PCR扩增。16SrRNA通用引物由Palumbi等（1991）设计，引物序列：16Sar:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3',16Sbr:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'。反应体系为10μL：50ngDNA,0.25UTaqDNA聚合酶，1μL10×PCRbuffer，0.8μLdNTPs，1μM引物，5.15μL灭菌超纯水。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃（16SrRNA）或54℃（COI）退火45s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳图如图1和图2所示。对PCR产物进行测序，设计的COIY引物扩增产物片段长度约614bp（图1），选用的16SrRNA通用引物扩增产物片段长度约530bp（图2），1-4代表长牡蛎，5-8代表岩牡蛎，M代表100bpDNAmarker。使用软件ClustalW对测得序列进行序列比对，使用软件BioEdit进行酶切位点分析，选择内切酶AluⅠ进行酶切，酶切位点分析结果如图3和图4所示，C.gigas代表长牡蛎，C.nippona代表岩牡蛎，Consensus代表相同的碱基部分，下划线标出的是AluⅠ酶切位点。酶切反应体系为10μL，包括5μL的PCR产物，0.5μL的限制性内切酶AluⅠ(5U;Takara),1μL的10xbuffer酶切缓冲液，3.5μL的灭菌超纯水。酶切反应体系在37℃反应过夜。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切电泳结果如图5和图6所示，1、2代表长牡蛎，3、4代表岩牡蛎，M代表100bpDNAmarker。COI基因片段经AluⅠ酶切后，长牡蛎产生38bp+102bp+474bp三个片段，岩牡蛎产生236bp+378bp两个片段（图5）。长牡蛎16SrRNA扩增片段经AluⅠ酶切后得到73bp+457bp两个片段，而岩牡蛎16SrRNA片段酶切后得到36bp+124bp+370bp三个片段（图6）。根据酶切图谱即可将有效鉴别岩牡蛎与长牡蛎。本专利技术有以下优点：本专利技术提供了一对用于鉴定岩牡蛎与长牡蛎的COI序列扩增引物，利用该引物进行鉴定操作简单、检测快速，仅仅需要PCR扩增目的基因片段，经特异性内切酶酶切、电泳后，即可有效鉴别岩牡蛎与长牡蛎。此技术对仪器设备要求低，相比形态学方法可靠性高，相对于PCR测序鉴定物种的方法更加经济、节约成本。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进一步解释和说明。本实施例所用的岩牡蛎与长牡蛎取自山东荣成养殖基地。每种牡蛎各取18个个体，共36个个体。登陆美国国家生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下载已有的岩牡蛎和长牡蛎线粒体COI序列（岩牡蛎Genbank登录号为：HM015198，长牡蛎Genbank登录号为：AB033687）。利用Mega6.0软件对下载的序列进行对比。使用引物设计软件PrimerPremier5在序列的相对保守区域设计引物。设计的COI引物序列为：COIY-F:5'-CTATTAGAAATATGCGGTCTG-3',COIY-R:5'-AACAAAGTAAGTATCGTGAAG-3'。使用苯酚-氯仿法提取岩牡蛎与长牡蛎DNA，并稀释为50ng/μl的工作液备用。使用步骤3设计的COI引物与16SrRNA通用引物在岩牡蛎与长牡蛎个体中扩增目的基因片段。16SrRNA通用引物：16Sar:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3',16Sbr:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'。PCR反应体系为10μL：50ngDNA，0.25UTaqDNA聚合酶，1μL10×PCRbuffer，0.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR‑RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的COI引物，其特征在于，包括以下步骤：（1）下载已有的岩牡蛎与长牡蛎线粒体COI序列；（2）将下载的岩牡蛎与长牡蛎粒体COI序列比对分析，在保守区域设计引物；（3）提取岩牡蛎与长牡蛎DNA，使用设计的COI引物和16S rRNA通用引物，对提取的DNA样本进行PCR扩增；（4）对PCR产物进行测序，对测得序列进行序列比对与酶切位点分析；（5）选择合适的内切酶酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，根据酶切图谱鉴别岩牡蛎与长牡蛎。

【技术特征摘要】
1.一种岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR-RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的COI引物，其特征在于，包括以下步骤：（1）下载已有的岩牡蛎与长牡蛎线粒体COI序列；（2）将下载的岩牡蛎与长牡蛎粒体COI序列比对分析，在保守区域设计引物；（3）提取岩牡蛎与长牡蛎DNA，使用设计的COI引物和16SrRNA通用引物，对提取的DNA样本进行PCR扩增；（4）对PCR产物进行测序，对测得序列进行序列比对与酶切位点分析；（5）选择合适的内切酶酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，根据酶切图谱鉴别岩牡蛎与长牡蛎。2.如权利要求1所述，岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR-RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的COI引物，其特征在于，上述步骤（1）中通过登陆美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）的DNA序列数据库（GenBank）下载岩牡蛎与长牡蛎线粒体COI序列。3.如权利要求1所述，岩牡蛎与长牡蛎的线粒体PCR-RFLP鉴定方法以及一对用于鉴定的COI引物，其特征在于，上述步骤（2）中利用Mega6.0软件进行序列对比，利用软件PrimerPremier5设计引物，COI引物序列为：COIY-F:5'-CTATTAGAAATATGCGGTCTG-3',COIY-R:5'-AACAAAGTAAGTATCGTGAAG-3'。4.如权利要求1所述，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琪，刘凯凯，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37