本发明专利技术提供了一种筛选和研究线粒体疾病致病基因果蝇模型的构建方法及其应用，本发明专利技术的方法中使果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；并且使果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白，通过线粒体定位的第一荧光蛋白标记线粒体，通过神经细胞膜定位的第二荧光蛋白标记神经细胞，就可以实现体内条件下对神经系统内线粒体功能的研究。使用该方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究线粒体致病基因，能够满足线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种筛选和研究致病基因的模型构建方法及其应用，尤其针对筛选和研究线粒体疾病致病基因的果蝇模型和相应的构建方法与应用。
技术介绍
线粒体疾病是以线粒体功能异常为显著特征的一类重大疾病。线粒体疾病在美国新生儿中的患病比率为1/4000，我国目前尚缺乏完整的线粒体疾病流行病学资料，但根据多家医院的资料显示，线粒体疾病在某三甲医院的接诊病例每年可高达几百甚至上千例，提示该病在中国并不罕见。线粒体疾病是一种遗传性疾病，目前已知的线粒体疾病致病基因超过100个，包括线粒体自身编码的基因以及细胞核编码的线粒体基因，除此之外，可能还存在许多未知的线粒体疾病基因。线粒体疾病临床表现涉及到人类多个系统，包括视觉神经、听觉神经、外周感觉神经、骨骼肌、心肌、肝脏、肾脏和消化系统等，尤其以神经系统表现最为显著，与此同时，病人常常表现为多个系统病变叠加。目前尚无可靠的线粒体疾病治疗药物问世。线粒体疾病临床表现复杂且往往存在多个系统病理叠加的现象，使得临床诊断困难重重。线粒体疾病致病基因众多，每个基因的致病机制可能大相径庭，导致确切的分子机制十分不清楚，给临床治疗带来了极大的障碍。造成以上困难的原因主要有：一是致病基因众多，难以开展系统的分子机制研究；二是缺乏高效的线粒体疾病致病基因筛选和研究的动物模型。目前针对线粒体疾病分子机制的研究主要是基于单个基因的生化模型和细胞模型进行，转基因动物模型主要使用大小鼠进行。虽然大小鼠在进化上与人类比较接近，但是其固有的长生命周期、高成本等不足，严重阻碍了转基因鼠模型在线粒体疾病研究中的应用。因此，本领域技术人员致力于开发使用成本低，且容易制备的线粒体疾病动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种筛选和研究线粒体疾病致病基因果蝇模型的构建方法及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种构建转基因果蝇模型的方法，所述方法包括步骤：(1)使所述果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；和(2)使所述果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白；从而构建出所述转基因果蝇模型；其中，所述第二荧光蛋白的荧光与所述第一荧光蛋白的荧光不同。在另一优选例中，所述第一荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。在另一优选例中，所述第二荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。在另一优选例中，所述第一荧光蛋白为绿色荧光蛋白；和/或所述第二荧光蛋白为红色荧光蛋白。在另一优选例中，所述果蝇模型的基因型为dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb。在另一优选例中，所述步骤(1)中包括步骤：(1.1)将dpr-Gal4基因型果蝇与UAS-mitoGFP基因型的果蝇杂交，然后挑选出子代中同时含有这两个转基因的处女果蝇；(1.2)将步骤(1.1)获得的处女果蝇与w1118果蝇进行杂交，挑选杂交后子代中眼睛颜色最深的雄果蝇；(1.3)将步骤(1.2)中获得的雄果蝇分别与Sco/Cyo基因型果蝇进行单独杂交；(1.4)确定步骤(c)杂交成功以后，验证所述雄果蝇是否携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP基因，如果所述雄果蝇同时携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP两个转基因，便将该雄果蝇的子代收集起来；由此构建出绿色荧光蛋白标记神经细胞线粒体的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo基因型果蝇；在另一优选例中，所述步骤(2)中包括步骤：(2.1)将步骤(1.4)建立的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo基因型果蝇与w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb基因型果蝇杂交，从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb基因型雄果蝇；(2.2)与步骤(2.1)同时，将UAS-mCD8-mCherry基因型果蝇与w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb基因型果蝇杂交,从子代中挑选+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb基因型处女果蝇；(2.3)将步骤(2.1)获得的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb基因型雄果蝇和步骤(2.2)获得的+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb基因型处女果蝇杂交，从子代中挑dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb基因型果蝇,由此完成所述转基因果蝇模型的构建。本专利技术的第二方面，提供了一种筛选和研究线粒体致病基因的方法，所述方法包括步骤：(1)提供携带RNAi基因的雄性果蝇；(2)将dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb基因型雌性果蝇与携带RNAi基因的雄性果蝇杂交，挑选同时含有dpr-Gal4基因、UAS-mitoGFP基因、RNAi基因、和UAS-mCD8-mCherry基因的子代果蝇；观察所述子代果蝇的翅膀感觉神经元中线粒体形态和数量以及神经束的完整性。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了研究线粒体疾病的果蝇模型。图2显示了基于果蝇模型的线粒体疾病致病基因快速筛选技术流程图。图3显示了线粒体疾病致病基因筛选成果。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得一种构建转基因果蝇模型的方法，该方法中使果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；并且使果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白，通过线粒体定位的第一荧光蛋白标记线粒体，通过神经细胞膜定位的第二荧光蛋白标记神经细胞，就可以实现体内条件下对神经系统内线粒体功能的研究。使用该方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究线粒体致病基因，能够满足线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。转基因果蝇模型果蝇的遗传背景清晰，生命周期短，每代只需要10天左右，饲养成本也较为低廉，十分适合线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建转基因果蝇模型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)使所述果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；和(2)使所述果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白；从而构建出所述转基因果蝇模型；其中，所述第二荧光蛋白的荧光与所述第一荧光蛋白的荧光不同。
【技术特征摘要】
1.一种构建转基因果蝇模型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)使所述果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；和(2)使所述果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白；从而构建出所述转基因果蝇模型；其中，所述第二荧光蛋白的荧光与所述第一荧光蛋白的荧光不同。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果蝇模型的基因型为dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中包括步骤：(1.1)将dpr-Gal4基因型果蝇与UAS-mitoGFP基因型的果蝇杂交，然后挑选出子代中同时含有这两个转基因的处女果蝇；(1.2)将步骤(1.1)获得的处女果蝇与w1118果蝇进行杂交，挑选杂交后子代中眼睛颜色最深的雄果蝇；(1.3)将步骤(1.2)中获得的雄果蝇分别与Sco/Cyo基因型果蝇进行单独杂交；(1.4)确定步骤(c)杂交成功以后，验证所述雄果蝇是否携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP基因，如果所述雄果蝇同时携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP两个转基因，便将该雄果蝇的子代收集起来；由此构建出绿色荧光蛋白标记神经细胞线粒体的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo基因型果蝇。6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：方燕姗，曹旭，王海琼，王青瑶，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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