一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用；该方法包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。本发明专利技术利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，可以简单、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，是一种具有高特异性和灵敏度的DNA检测新方法，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。通过运用本发明专利技术的方法成功检测人宫颈癌细胞中HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因。

A method of DNA detection and typing based on CRISPR and its application

The invention discloses a method for detecting CRISPR and type of DNA based method and its application; the method comprises the following steps: (1) using a pair of universal primers to amplify the target DNA PCR; (2) with Cas9/sgRNA cutting target after DNA amplification; (3) connected to the target DNA is cut by DNA ligase (4;) amplification of target DNA after connecting with PCR. The invention uses the specific recognition technology of CRISPR DNA cutting characteristics, simple, rapid and sensitive to the target DNA for specific detection and classification is a new detection method with high specificity and sensitivity of DNA, successfully avoiding the nucleic acid detection and typing key bottleneck in the domain of nucleic acid hybridization. The specific PCR primer design problems. The L1 and E6/E7 genes of HPV16 and HPV18 in human cervical cancer cells were successfully detected by the method of the present invention.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用。
技术介绍
对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。简而言之，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如IlluminaNovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。Ishino等人于1987年首次在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)。CRISPR系统有三种不同类型(I，II和III型)。I型和III型系统需要多种Cas蛋白互相作用才能发挥正常功能，因此要比II型复杂很多。在II型系统中，只需要一种蛋白(Cas9)，Cas9与引导RNA(gRNA)结合后能够特异地识别和切割双链DNA(dsDNA)。Cas9是II型系统的标志蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPRRNA(crRNA)的引导下发挥作用。tracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA特异地与靶DNA的20个核苷酸序列互补。因此crRNA决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。将tracrRNA和crRNA整合成一个RNA即单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。Cas9介导的位点特异性切割依赖于sgRNA和PAM(protospaceradjacentmotif)。如果目标DNA中有PAM，在sgRNA的引导下，Cas9在PAM上游三个碱基处切割靶DNA。目前，由于简便和高效，CRISPR-Cas9系统已被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外,dCas9(deadCas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但很少应用于核酸检测。凭借高特异性的DNA切割能力(能够区分单碱基)，Cas9/sgRNA在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。最近，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型。基于CRISPR的高特异性，CRISPR-Cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的cas13a/C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)。这些研究表明，CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而，在报道的基于Cas9的DNA检测中，Cas9/sgRNA系统尚未直接用于检测和分型基因组DNA。HPV是双链DNA病毒，与子宫颈癌，肛门癌和其他癌症的发病机制密切相关。大约有100种不同变异类型的HPV。根据致癌能力的不同，HPV分为高危型HPV(hrHPV)和低危型HPV(lrHPV)。世界上最常见的hrHPV是HPV16和HPV18，它们导致了大约70％的宫颈癌。其他hrHPV包括HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、82等。LrHPV包括HPV6、11、40、42、43、44、61、81等。因其丰富的DNA多态性，HPV是研究DNA检测及分型技术良好的实验材料。因此，本专利技术以HPVDNA为材料，进行本专利技术方法的论证。聚合酶链反应(PCR)作为最常用的核酸检测方法之一，被几乎所有的生物学、检测和诊断相关的实验室作为基本的核酸检测工具。在传统PCR(tPCR)的基础上，衍生了定量PCR(qPCR)，并被广泛应用于DNA检测和诊断。另外，最近开发出的数字PCR(dPCR)已经显示出其作为临床检测工具的巨大潜力和优势。因此，CRISPR和PCR技术的结合为开发出新的核酸检测和分型技术提供了新的机会。这些技术同时具备了CRISPR技术的高特异性和PCR技术的高灵敏度，在DNA检测和基因分型上更有优势。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，该方法被命名为CARP，即CRISPR辅助反向PCR(CRISPR-assistantreversePCR)或者Cas9/sgRNA相关的反向PCR。该方法为一种快速，便宜和灵敏的基于CRISPR的PCR方法，可以有效地对目标DNA进行特异性检测和分型。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。其中，步骤(1)所述通用引物为可将含有靶DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物是单一序列或简并序列。步骤(2)所述Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA为利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割。步骤(3)所述DNA连接酶连接被切割的靶DNA为利用DNA连接酶处理步骤(2)产生的DNA，产生分子内或分子间的平末端DNA连接。作为优选，其中所使用的的DNA连接酶为T4DNA连接酶及其他具有类似功能的酶。步骤(4)所述用PCR扩增连接后的靶DNA为使用一对在靶DNA上呈反向的PCR引物；该对反向的PCR引物在靶DNA未发生C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。2.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤(1)所述通用引物为可将含有靶DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物是单一序列或简并序列。3.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤(2)所述Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA为利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导下靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割。4.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤(3)所述DNA连接酶连接被切割的靶DNA为利用DNA连接酶处理步骤(2)产生的DNA，产生分子内或分子间的平末端DNA连接。5.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，张贝贝，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32