用于核酸合成和扩增的组合物、 方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于合成核酸分子的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用以在单步骤RT‑PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括用于增强对PCR抑制剂的耐受性的一种或多种试剂。

Compositions, methods and kits for the synthesis and amplification of nucleic acids

The invention relates to a composition, method and kit for the synthesis of nucleic acid molecules. More specifically, provides compositions, methods and kits for amplification of nucleic acid molecules in a single step RT PCR method, which comprises one or more reagents for enhanced tolerance to PCR inhibitor.

【技术实现步骤摘要】
用于核酸合成和扩增的组合物、方法和试剂盒本申请是201180037898.4的分案申请。相关申请的交叉参考:本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年6月21日提交的美国临时专利申请号61/357,021和2011年3月25日提交的美国临时专利申请号61/467,852的优先权的利益，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。领域:本公开内容涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括一种或多种用于增强对PCR抑制剂的耐受性的试剂。背景:核酸的检测、分析、转录和扩增是现代分子生物学中最重要的方法中的一些方法。此类方法用于核酸分析的应用在基因表达的研究、感染性试剂或遗传疾病的诊断、cDNA的产生和逆转录病毒的分析等等应用中特别重要。逆转录RNA，随后通过聚合酶链式反应(PCR)进行cDNA扩增，通常称为RT-PCR或RNA-PCR，已被广泛用于检测和定量核酸靶并且对于病毒基因分析特别重要。致癌病毒及其在癌症的病理发生中的作用的研究可在癌症的诊断和治疗中具有重要意义。然而，致癌病毒的检测中的可变性可使这些研究成为挑战性的。检测法的灵敏性和特异性是关键问题。早期检测可通过使用分子生物学技术检测还未经历血清转换的样品中的致癌病毒核酸来实现，此类技术适用于不能在组织培养中繁殖的病毒。常规地，免疫检测法已被用于检测致癌病毒的存在，但此类方法具有几个缺点。在人乳头瘤病毒(HPV)(其可引起宫颈癌)的情况下，检测因早期病毒蛋白质的低表达和可区分HPV类型的的灵敏且特异的高质量抗体的缺乏而十分困难(VillaandDenny,InternationalJournalofGynecologyandObstetrics,94(Suppl.1):S71-S80(2006))。当样品因可以在样品收集之前已发生数目或数年的感染(如在爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的情况下)而显示残余的抗体水平时，结果还可引起误导或不能得出结论，所述爱泼斯坦-巴尔病毒与何杰金淋巴瘤及其它癌相关(国家传染病中心(NationalCenterforInfectiousDiseases)。“爱泼斯坦-巴尔病毒和传染性单核细胞增多症”，CDC.http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/ebv.htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的检测不仅因序列特异性引物结合而具有高度特异性的有利方面，而且其还因为其扩增更短的核酸片段的能力而比其它杂交技术例如Northern和Southern印迹那样麻烦比它们更灵敏。序列特异性探针结合给实时PCR添加了额外层的特异性并且具有提供病毒载量信息的额外有利方面。RT-PCR通常包括两个单独的分子合成：(i)cDNA从RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通过PCR扩增的复制。可使用两种或更多种酶，通过单步(或偶联)RT-PCR法进行RT-PCR，其中将至少两种单独的酶(例如，逆转录酶和聚合酶)分别用于初始cDNA合成和随后的扩增。在单步RT-PCR中，将逆转录和PCR扩增组合至单个反应混合物中，这提供了优于两步骤RT-PCR(其中使用两个不同的或单独的反应进行合成和扩增步骤)的众多有利方面。单步骤RT-PCR需要比二步骤RT-PCR更少的对于反应混合物和核酸产物的操作(例如，两个反应步骤之间为了添加组分或酶而进行的反应管的打开)，从而是劳动密集度较低并且耗时较少的方法。必要时，单步骤RT-PCR还允许使用更少的样品，以及减小污染的风险(Sellner和Turbett,Biotechniques25:234-238(1998))。然而，单步骤RT-PCR法的使用具有一些缺点。例如，逆转录酶对DNA聚合酶的比率的个体优化对于用于单步骤RT-PCR的即可使用的组合物或试剂盒通常是不可行的。几篇报道也已证明当在单管RT-PCR反应中组合使用时逆转录酶与DNA聚合酶之间的干扰导致低灵敏性或结果的缺乏(Sellner,L.N.,等人,Nucl.AcidsRes.20:1487-1490(1992))。此外，从其提取病毒核酸的样品通常包含抑制PCR的额外化合物。土壤和粪便中的腐殖酸、血液中的血色素、血清中的免疫球蛋白G以及各种血液抗凝剂如肝素和柠檬酸盐全都是此类抑制剂的实例。此类抑制剂在核酸提取和纯化过程中不可能被完全去除，从而负面影响下游PCR扩增，如通过当利用实时PCR测定时Ct(即，循环阈值)的增加和dRn(即，标准化报道分子信号的差异)的减小所反映的。与低dRn偶联的高Ct通常表示定量PCR(qPCR)和逆转录酶-qPCR(RT-qPCR)应用中的反应中的低靶核酸浓度。显示减小的扩增或无扩增的反应表示靶核酸不存在或以少至不可被检测的量存在。包含可检测量的靶但因PCR抑制剂的存在而被抑制的反应可显示假的高Ct和低dRn，这可导致用户相信靶核酸的量少于实际存在的量。如果抑制的水平足够严重，则反应可能不能完全扩增，从而导致假阴性结果。由于核酸合成应用对分子生物学和细胞生物学领域的重要性，因此以一般化的即可使用的组合物的形式存在的显示高灵敏性的、不受样品的量限制、减少医生操作的量、使污染的风险降至最低、使试剂的费用减少至最少、以及使核酸终产物的量最大化的单步骤RT-PCR系统，是本领域所需要的。此外，减少或消除PCR抑制剂的负面影响的方法，特别地当分析其中样品来源通常包含此类抑制剂的病毒靶时，是确保准确结果所必需的。概述:本专利技术总地说来涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步骤RT-PCR法中使用与一种或多种DNA聚合酶例如来自水生栖热菌(Thermophilusaquaticus)(Taq)的DNA聚合酶组合的一种或多种逆转录酶例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒。优选地，所述组合物还包含一种或多种用于增强对通常在从其提取核酸，特别地病毒核酸的样品(例如,粪便、血液、土壤等)中发现的多种化合物的耐受性(即，阻断或减缓PCR抑制)的试剂。此类PCR抑制剂阻断剂可包括例如牛血清白蛋白(BSA)和鱼胶(fishgelatin)。本教导从而有利于核酸分子的快速和高效的扩增和靶序列的检测和定量(这可用于多种工业、医学、法医和诊断目的)。本文中公开的实施方案对于病毒基因包括RNA和DNA靶的快速扩增和检测是特别有用的。具体地，本教导涉及包含至少一种活性DNA聚合酶和至少一种活性逆转录酶(RT)的组合物。在一些实施方案中，此类组合物还包含至少一种PCR抑制剂阻断剂,其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂(如果存在的话)的耐受性。在一些实施方案中，本专利技术的逆转录酶为逆转录酶。在一些优选实施方案中，逆转录酶是热稳定性的。例如，热稳定性逆转录酶可以是M-MLV逆转录酶、其突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，M-MLVRT可包含一个或多个突变。此类突变可包括例如：Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、Q190、T197、H204、V223、M289、T306或F309。在一些实施方案中，逆转录酶的浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于RT‑PCR的组合物，其包含：至少一种热稳定性DNA聚合酶，至少一种热稳定性逆转录酶(RT)，和鱼胶，其中相对于不含任何PCR抑制剂阻断剂的组合物，所述鱼胶增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性并且降低Ct；其中所述PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸和肝素。

【技术特征摘要】
2010.06.21 US 61/357,021;2011.03.25 US 61/467,8521.用于RT-PCR的组合物，其包含：至少一种热稳定性DNA聚合酶，至少一种热稳定性逆转录酶(RT)，和鱼胶，其中相对于不含任何PCR抑制剂阻断剂的组合物，所述鱼胶增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性并且降低Ct；其中所述PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸和肝素。2.权利要求1的组合物，其中所述热稳定性逆转录酶为M-MLV逆转录酶或其突变体、变体或衍生物。3.权利要求2的组合物，其中所述MMLVRT包含选自Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、Q190、T197、H204、V223、M289、T306和F309的一个或多个突变。4.权利要求1的组合物，其中所述热稳定性DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶或其突变体、变体或衍生物。5.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20℃为液体或凝胶。6.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20℃不为固体。7.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20℃不冻结。8.权利要求1的组合物，其中当贮存于-20℃时，所述组合物在使用之前不需要解冻。9.权利要求1的组合物，还包含一种或多种核苷酸(dNTP)。10.权利要求9的组合物，其中所述核苷酸选自dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。11.权利要求9的组合物，其中所述核苷酸的每一种的浓度为约0.5mM至5mM。12.权利要求1的组合物，还...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·胡，J·伯克曼，P·严，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US