一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法技术

一种应用于生物医学临床诊断领域中的包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac?site的上下游引物，以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac?site的pMD18-T质粒，使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac?site片段分离下来，与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物。该发明专利技术制备的含有HCV和HIV-1RNA片段的假病毒颗粒方法简单、容易操作、获得的假病毒克隆纯度高、是丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的工作标准品和质控品的理想原料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学临床诊断领域中的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法。
技术介绍
丙型肝炎和艾滋病是我国最为重视的两种重大传染病。其中丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C，HCV）诱发，艾滋病由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）诱发，这两种病毒均为RNA病毒。HCV RNA和HIV RNA载量检测对于病毒感染的早期诊断，以及抗病毒治疗疗效和病人治疗效果评判，是一个非常重要的手段。目前，人们逐渐采用荧光定量RT-PCR法（real time reaverse transcription PCR，RT-PCR）来检测RNA病毒载量，此类方法灵敏度高，特异性强，动力学线性范围宽，已经成为该类病毒RNA检测的主要方式。由于裸露的RNA分子特别不稳定，因此使用荧光定量RT-PCR法检测RNA病毒载量，必须要有严格的质量控制措施。很关键的一点就是要有高稳定性且无传染性的RNA病毒标准品和质控品。目前，商业化的HCV和HIV荧光定量检测试剂盒的标准品和质控品，主要包括裸露RNA片段，病毒颗粒以及人工假病毒颗粒（armored RNA）。裸露RNA片段容易受到环境中广泛存在的核糖核酸酶（RNase）的降解，而且裸露的RNA标准品和质控品不能参与样本的提取过程，因此导致定量结果偏差过大。用病毒颗粒作为标准品和质控品，其本身也不易降解，可是在试验中应用病毒颗粒无疑增加了生物风险，并且对各种病毒颗粒操作和使用国家有严格的法规要求，这在无形中增加科研和生产的经济成本，提高了分子诊断试剂的准入门槛。因此，研究开发一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法是目前急待解决的新课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该专利技术安全简便，可同时用于实时荧光定量PCR检测，该双元假病毒颗粒具有耐核糖核酸酶、稳定性好，易于保存和运输，对于丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的开发具有较强的实用价值。本专利技术的目的是这样实现的：一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆（1）设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，上游引物序列为5'-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-'3（SEQ No.1）；下游引物序列为5'-GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC-'3（SEQ No.2）；（2）以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；（二）假病毒表达载体pET-28b/MS2的构建（1）提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T质粒，然后使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，将其与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物；（2）将上述连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出1700bp左右片段的，为正确的阳性克隆；（三）双元假病毒表达载体pET-28b/MS2/HCV+HIV的构建（1）以HCV5'UTR和HIV-15'LTR区域序列为制备假病毒的目标序列，其中HCV5'UTR序列长度为230bp，HIV-15'LTR序列长度为250bp；（2）人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，片段序列为：5'-ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGAAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT-'3（SEQ No.3），其中CAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG为HCV5’UTR序列，其他为HIV-15'LTR序列；（3）使用BamHI限制性内切酶将上述片段进行酶切，然后将其正向连接进入经过BamHI酶切后的pET-28b/MS2载体中，得到连接产物；（4）将上述连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用BamHI和SacI进行双酶切鉴定，将正向连接的克隆作为正确的阳性克隆；（四）诱导表达和纯化将上述含有pET-28b/MS2/HCV+HIV的阳性克隆接种在含卡那霉素的SOB液体培养基中振荡培养过夜，在培养基中添加IPTG来进行诱导表达；离心收集菌体，再进行超声碎菌处理，将细菌破碎物在进行14000r/min离心20min，取上清转移到另一干净离心管中；在上清中加入100U RNase A和50U DNase Ⅰ酶，37℃消化1h，将消化后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，核实上清液中的内源性DNA和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其
特征在于：该制备方法包括如下步骤：
（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆
（1）设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site
的上下游引物，上游引物序列为5'-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-'3（SEQ 
No.1）；下游引物序列为5'-GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC-'3（SEQ No.2）；
（2）以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将
扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；
（二）假病毒表达载体pET-28b/MS2的构建
（1）提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T
质粒，然后使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白
基因+Pac site片段分离下来，将其与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b
载体进行连接，得到连接产物；
（2）将上述连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取阳性克隆进行培养，然后
提取质粒用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出1700bp左右
片段的，为正确的阳性克隆；
（三）双元假病毒表达载体pET-28b/MS2/HCV+HIV的构建
（1）以HCV5'UTR和HIV-15'LTR区域序列为制备假病毒的目标序列，其
中HCV5'UTR序列长度为230bp，HIV-15'LTR序列长度为250bp；
（2）人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，片段序列为：
5'-ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT
ACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGC
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GCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCT
CTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT-'3（S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李望丰，蔡一荣，关尔鑫，赵世源，王丹，肖樊，周凯，任旭，
申请(专利权)人：东北制药集团辽宁生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：