本发明专利技术涉及呼吸道合胞病毒样颗粒，建立了一种新的制备呼吸道合胞病毒样颗粒的方法，并用于动物免疫。本发明专利技术按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F、G基因进行密码子优化，分别克隆到穿梭载体中，获得重组腺病毒质粒，转染，获得重组腺病毒FGAd-Msyn，FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn；将重组腺病毒感染Vero细胞，获得病毒样颗粒；采用蔗糖密度梯度离心的方法进行病毒样颗粒纯化；并用于动物免疫。本发明专利技术采用腺病毒载体制备病毒样颗粒，建立了一种新的病毒样颗粒制备方法，并通过密码子优化，提高蛋白表达量，提高病毒样颗粒的产量，获得较好的免疫效果，并且相对安全。
【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道合胞病毒样颗粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)病毒样颗粒(Virus like particles, VLPs)及其制备方法和应用。
技术介绍
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒性病原，发病高峰期为出生后的6周至6个月，尤其是2~6个月婴幼儿，发病率高，出生一年内约有70%婴儿被感染。RSV也是我国婴幼儿急性下呼吸道感染的主要病毒病原，引起婴幼儿流行性喘憋性肺炎或毛细支气管炎，分布广泛，流行发病率为0.24%~21.9%，住院病死率为0.5%~4%。老人和免疫缺陷人群也易遭受RSV引起的严重感染。世界卫生组织等估计全球每年发病人数为6400万、死亡人数为16-100万。近期研究认为，RSV感染引起的社会经济负担可能比季节性流感更加严重，但由于RSV的诊断、预防及治疗均缺乏有效、可靠的方法，面对RSV感染，人们因缺乏治本之策，常将其统称为“普通感冒”或“病毒性感染。为此，世界卫生组织及美国医学研究院有关21世纪疫苗报告中均将开发RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RSV属于副黏病毒科，肺炎病毒属，基因组为单股负链，编码11种蛋白，包括3种跨膜包膜糖蛋白(F、G和SH)，4种核壳体蛋白(N、P、L和M2-1)，2种非结构蛋白(NSl和NS2)，I种基质蛋白(M)和I种RNA调节因子(M2-2)。其中G、F为RSV主要中和抗原。尽管RSV作为呼吸道病原体的重要性已在50多年前就被广泛认识，已尝试过多种形式的RSV疫苗，例如:以传统方法获得的减毒RSV活疫苗、福尔马林灭活疫苗(Formalin-1nactivated RSV vaccine, F1-RSV)、核酸疫苗、病毒载体疫苗和亚单位疫苗等。由于作为RSV疫苗主要接种对象的2-6个月低龄婴幼儿存在免疫系统发育不成熟及母传抗体干扰等问题，上述疫苗在安全性或免疫原性等方面均有不足，至今尚未有能够用于预防人RSV感染的疫苗问世。`病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)是一种不含病毒核酸，在形态结构上与病毒类似的颗粒状物质，与蛋白疫苗相比，VLPs疫苗不仅有很好的安全性，而且由于VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，能迅速、有效地诱导机体产生强大的体液免疫应答。在新型疫苗的研究中，取得了巨大成功。如美国默克公司(Merck)的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) HPV6/ll/16/18VLPs 四价疫苗Gardasil和葛兰素史克公司(GSK)的HPV16和HPV18双价疫苗Cervarix已经用于临床，这两种VLPs疫苗均可预防宫颈癌。用于临床的VLPs疫苗还有乙肝病毒(hepatitis B virus)疫苗和流感病毒(influenza virus)疫苗。由我国自主研发的戍型肝炎病毒(hepatitis Evirus, HEV)疫苗也已经上市。另外,至少有12种VLPs疫苗相继进入临床试验,如LigoCyte公司的诺瓦克病毒(Norwalk virus)疫苗和MedImmune公司的细小病毒(parvovirus)疫苗等。这些进展显示VLPs疫苗是一种具有很好发展前景的新型疫苗。RSV VLPs疫苗的研究已见文献报道，以往多采用杆状病毒载体系统或真核质粒制备RSV VLPs，但均存在明显的缺点，如利用杆状病毒载体系统制备RSV VLPs时，VLPs在出芽过程中携带了大量昆虫细胞的膜蛋白，该VLPs应用于人时，可能会引起过敏反应；真核质粒制备RSV VLPs时，存在表达量低的问题。因而，迫切需要建立一种新的RSV VLPs制备方法。
技术实现思路
本专利技术解决的第一个技术问题是提供一种呼吸道合胞病毒样颗粒。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案:本专利技术提供了一种呼吸道合胞病毒样颗粒，该病毒样颗粒包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述蛋白由密码子优化的M基因进行编码。进一步地，所述密码子优化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。 进一步地，所述呼吸道合胞病毒颗粒还可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其组合，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码。进一步地，所述密码子优化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，密码子优化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。本专利技术对RSV A亚型Long株F、M、G蛋白基因序列进行密码子优化，目的是增加蛋白的表达量。本专利技术解决的第二个技术问题是一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，利用重组腺病毒制备呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，该方法同样适于其他病毒的病毒样颗粒制备，采用的技术方案为，将所述的含有M蛋白的重组腺病毒FGAd-Msyn单独感染Vero细胞，或将FGAd-Msyn与含有呼吸道合胞病毒F蛋白的重组腺病毒FGAd-Fsyn和/或含有呼吸道合胞病毒G蛋白的重组腺病毒FGAd-Gsyn，按适当比例混合感染Veix)细胞，获得病毒样颗粒，其中，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码，其步骤包括:(I)针对哺乳动物细胞对密码子的偏好性，对M、F和G基因进行密码子优化，分别命名Msyn、Fsyn> Gsyn,将Msyn、Fsyn> Gsyn分别克隆到穿梭载体pShuttle_CMV中,得到重组穿梭质粒 pShuttle-CMV-Msyn、pShuttle-CMV-Fsyn、pShuttle-CMV-Gsyn ；(2)将重组穿梭质粒转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA+E.coliBJ5183/p的感受态细胞，筛选鉴定，获得分别有Msyn、Fsyn, Gsyn基因的重组腺病毒质粒pAdeasy-Msyn, pAdeasy-Fsyn,pAdeasy-Gsyn ；(3)分别将 pAdeasy-Msyn,pAdeasy-Fsyn,pAdeasy-Gsyn 转染 293 细胞进行表达，获得重组腺病毒 FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn ；(4)将 FGAd-Msyn 单独接种 Vero 细胞，或将 FGAd-Msyn 与 FGAd-Fsyn 和 / 或FGAd-Gsyn混合感染Vero细胞，获得含病毒样颗粒的上清液；(5)蔗糖密度梯度离心进行纯化，获得纯化后的病毒样颗粒。进一步地，步骤(5)中蔗糖密度梯度离心的步骤为:(I)将上清液离心；(2)弃掉上清，将沉淀重悬，分别加入60%、50%、30%蔗糖垫层，离心；(3)收集目的条带位置的蛋白带，再分别加入60%、50%、40%、30%、20%蔗糖垫层，离心;(4)收集密度接近的样品，加入预冷的NTE混匀，离心；(5)弃掉上清，用预冷的NTE重悬沉淀，分装。包含所述呼吸道合胞病毒样颗粒的疫苗。进一步地，所述疫苗为注射剂、口服剂、滴鼻剂、喷雾剂或透皮剂形式。所述呼吸道合胞病毒样颗粒在制备用于预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述M蛋白由密码子优化的M基因进行编码。
【技术特征摘要】
1.一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述M蛋白由密码子优化的M基因进行编码。2.根据权利要求1所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，还可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其组合，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码。3.根据权利要求1所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，所述密码子优化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。4.根据权利要求2所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，所述密码子优化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，密码子优化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。5.一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，利用重组腺病毒制备呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，该方法同样适于其他病毒的病毒样颗粒制备，其步骤包括: (1)按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F和G基因进行密码子优化，分别命名Msyn、Fsyn > Gsyn ； (2)将Msyn、Fsyn>Gsyn分别克隆到穿梭载体中,得到重组穿梭质粒,将重组穿梭质粒转化到含有腺病毒骨架质粒PAdEasy-1的RecA+E.coli BJ5183/p的感受态细胞，筛选鉴定，获得重组腺病毒质粒 pAdeasy-Msyn, pAdeasy-Fsyn, pAdeasy-Gsyn ； ...
【专利技术属性】
技术研发人员：何金生，付远辉，焦月盈，洪涛，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：
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