热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明专利技术的热启动Taq DNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，包括如下步骤：(1)重组表达载体的构建及转化；(2)重组菌的诱导表达；(3)粗酶制备和纯化；(4)抗体修饰。本发明专利技术提供的热启动Taq DNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。

Hot start TaqDNA polymerase and its preparation methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物化学及分子生物学领域，具体地说，涉及一种热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用。
技术介绍
TaqDNA聚合酶是从水生栖热菌中分离出的一种热稳定聚合酶，该酶基因编码区核苷酸序列为2496个碱基，编码832个氨基酸，是分子量为94KD的热稳定碱性蛋白，具有DNA结合能力。TaqDNA聚合酶良好的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的主要原因，是分子生物学中必不可少的工具酶。在PCR第一个循环变性之前，升温过程中引物和模板会有一些非特异性配对，如果此时TaqDNA聚合酶发挥活性，则容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经后续的指数扩增，将严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。热启动PCR技术可以用来解决非特异性扩增产物的出现，引物二聚体的形成，目标片段无扩增等问题。热启动PCR技术要通过特定的热启动DNA聚合酶来实现热启动PCR过程，热启动PCR过程中需要封闭反应体系中的组分来保证热启动PCR过程顺利进行。目前实现热启动PCR过程的方法主要包括：手工热启动法、物理隔绝法、化学封闭法及抗体修饰法等。其中手工热启动法操作步骤繁琐；物理隔绝法操作复杂，热启动效果差；化学封闭法需要预加热，易照成DNA损伤；抗体修饰法通过抗体特异性封闭酶活性中心，其中的特异性是基于抗原决定簇与抗体超变区的沟槽分子表面的结构互性与亲合性，高温加热前，抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体与TaqDNA聚合酶结合抑制了TaqDNA聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物和模板DNA引起的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增，提高了PCR扩增的特异性，该方法是目前商业化生产热启动TaqDNA聚合酶最为理想的方法之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种热启动TaqDNA聚合酶及其应用，该TaqDNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。本专利技术的另一目的是提供上述热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，即抗体修饰法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的热启动TaqDNA聚合酶，是经抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体修饰的TaqDNA聚合酶；其中，所述抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonalantibodyforHotStartPCRanti-Taqhigh，商品编号：TCP-101。本专利技术的热启动TaqDNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，根据GenBank公布的TaqDNA聚合酶基因序列(D32013.1)，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的TaqDNA聚合酶基因片段；然后将优化的TaqDNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达TaqDNA聚合酶的重组工程菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析等方式，完成TaqDNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体与TaqDNA聚合酶进行特异性结合，完成TaqDNA聚合酶的配基修饰，即为热启动TaqDNA聚合酶。本专利技术中，优化的TaqDNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。前述方法包括：(1)重组表达载体的构建及转化；(2)重组菌的诱导表达；(3)粗酶制备和纯化；(4)抗体修饰。在本专利技术的一个具体实施方式中，重组表达载体的构建方法如下：人工合成优化的TaqDNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和NotI双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达TaqDNA聚合酶的重组菌。鉴定方法如下：挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和NotI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出2500bp左右片段的，为正确的阳性克隆。重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时。②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心10-15min，收集上清。粗酶制备和纯化：③梯度盐析：本专利技术采用三步盐析法沉淀TaqDNA聚合酶。具体如下：第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析。④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液。具体操作如下：先用平衡缓冲液平衡色谱柱(如Bio-ScaleTMMiniUNOsphereQ阴离子交换预装柱)5个色谱柱柱体积(CV)，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5CV的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱5CV，最后用60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱5CV，回收目的蛋白酶液。⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的TaqDNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存。(4)抗体修饰：将纯化的TaqDNA聚合酶酶液与抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动TaqDNA聚合酶。具体方法如下：⑥将纯化的TaqDNA聚合酶酶液用酶稀释液稀释，将0.5mg/mlTaqDNA聚合酶酶液与1mg/ml抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体按体积比2:1混合孵育。优选地，将TaqDNA聚合酶酶液与抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体于25℃孵育30min。⑦向上述混合体系中加入与0.5mg/mlTaqDNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液，即得热启动TaqDNA聚合酶，于-20℃以下贮存。优选地，本专利技术的三步盐析法为：第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热启动Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述热启动Taq DNA聚合酶是经抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCR anti‑Taq high，商品编号：TCP‑101。

【技术特征摘要】
1.一种热启动TaqDNA聚合酶，其特征在于，所述热启动TaqDNA聚合酶是经抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体修饰的TaqDNA聚合酶；其中，所述抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonalantibodyforHotStartPCRanti-Taqhigh，商品编号：TCP-101。2.权利要求1所述热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，其特征在于，根据GenBank公布的TaqDNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的TaqDNA聚合酶基因片段；然后将优化的TaqDNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达TaqDNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成TaqDNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体与TaqDNA聚合酶进行特异性结合，完成TaqDNA聚合酶的配基修饰，即为热启动TaqDNA聚合酶。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，优化的TaqDNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组表达载体的构建及转化：人工合成优化的TaqDNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和NotI双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达TaqDNA聚合酶的重组菌；(2)重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时；②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心10-15min，收集上清；其中，所述预裂解缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；所述裂解缓冲液的配方为：10mMTris-HCl，50mMKCl、1mMEDTA，1mMPMSF，0.5％TritonX-100，0.5％NonidetP40，pH＝8.0；(3)粗酶制备和纯化：③梯度盐析：采用三步盐析法沉淀TaqDNA聚合酶，具体如下：第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析；④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液；⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，宋璐，赵世源，蔡一荣，曲俊杰，徐桤，李铁男，赵倩，李望丰，谢占武，
申请(专利权)人：东北制药集团辽宁生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21