本发明专利技术涉及生物医学临床诊断领域，具体说是快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法。包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标和模板，所述核酸释放试剂SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)2SO4、1％甲酰胺，余量为水。本发明专利技术的优点在于一种能够高效快速释放肝炎病毒核酸的释放试剂的发明专利技术和使用。在核酸释放剂的作用下，核酸能够直接从微量样品中释放出来，直接加入PCR反应液进行荧光定量检测，从而实现快速核酸检测。无需单独提取样本核酸，直接在PCR反应管内完成核酸提取与荧光定量PCR的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学临床诊断领域，具体说是。
技术介绍
在我国多种流行性传染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，结核，梅毒等，对人类健康造成了巨大危害。临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进行检测和诊断，由于其灵敏性低和周期长等限制，仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不能及时准确地诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度好、特异性强和可定量等优点。但这项技术在进行确定病原体载量时仍存在操作复杂，费时，容易导致假阳性等缺点。因此，检测技术需要改进和提高，进而降低污染和简化操作过程。·目前在临床核酸检测中使用较多的是荧光定量PCR技术，该技术已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这项技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。可以对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋菌、结核分枝杆菌、淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。目前，常用的病原微生物实时荧光定量PCR技术包括探针类和染料类两种。在实际医学检验操作中，进行荧光定量PCR实验的模板是核酸。作为模板的核酸物质往往要进行纯化，甚至几次纯化，这样才能避免核酸中的杂质(如血清蛋白，胆红素，脂类等)抑制PCR反应。核酸纯化过程比较复杂，繁琐，耗时较长。这也导致了在临床样本的实际检测中，单位时间内核酸检测效率比较低下。另外，核酸纯化过程需要多次离心或移管等操作，也导致核酸以气溶胶的形式外溢到环境中，很容易造成样品检测的假阳性污染，这也是临床核酸检测实验室条件要求很高的主要原因。核酸纯化涉及到的基本原理基本上都是，首先使细胞膜破裂，染色体DNA和蛋白质变性，然后用有机溶剂抽提使核酸和蛋白分离或直接将核酸吸附于某些固体颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱，从而获取高纯度的核酸。目前市场上的核酸检测试剂盒中核酸纯化方法主要有以下几种(I)煮沸法。该方法主要是通过沸水浴裂解细胞，释放核酸物质，同时使蛋白质变性，然后通过离心沉淀的方式去除变性的蛋白质和杂质，最后回收核酸用于PCR扩增。该方法操作相对较简单，但是由于在高温变性蛋白质过程中，会导致部分核酸的损失。另外，这种方法获得的核酸仍然含有大量的杂质，因此也会产生PCR反应的抑制。(2)二氧化硅膜柱法。该方法首先是用异硫氰酸胍或盐酸胍作为细胞裂解和蛋白变性液来裂解细胞，然后核酸释放到上清液中。再将上清液过二氧化硅膜柱子，在异硫氰酸胍或盐酸胍作为离液盐的作用下，核酸被特异的吸附到二氧化硅膜柱上。然后用乙醇清洗膜柱，最后洗脱核酸进行PCR扩增。该方法获得核酸样品比较纯，但是，由于膜柱吸附效率较低，会导致部分核酸的丢失。(3)纳米磁珠法。该方法过程与二氧化硅膜柱法基本相同，只是用纳米磁珠法来代替二氧化硅膜柱。该方法获得的核酸纯度高，并且核酸回收率要远超二氧化硅膜柱法。以上三种市场主流核酸提取方法，虽然在原理上，操作上和回收得率上各不相同，每种方法都有其各自的优势和特点。但是，三种方法无一例外都有操作时间长，操作复杂，不利于人工大规模处理样本，以及核酸回收损失等这些缺点。在实际进行核酸检测的过程中，为了排除假阴性结果和确定PCR的反应效率，需要在PCR反应体系中加入内标(内对照分子)。内标可以监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA(RNA)提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。如中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内标，CN1664098A采用beta-肌动蛋白作为内标，CN1687454A采用res_l基因作为内标，CN1940087A采用了 RNA内标。然而，相对于PCR检测方法，人们对内标的研究工作却相对很少，特别是竞争性内标，其设计有一定的技术难点。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染可导致阳性结果，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重的因素之一。为防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高PCR诊断技术的准 确性，已成为急待解决的问题。在PCR产物中引入dU代替dT。这种dU化的PCR产物与尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG) —起孵育，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。采用UNG酶，在进行PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了 UNG酶作为审批条件之一。但在目前仍然存在一些技术性问题，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相应的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。检测肝炎病毒核酸的方法目前已有很多，且有很多商业化试剂盒生产。但目前定量试剂盒大部分技术仍存在操作复杂和灵敏性低，准确性差等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低污染的机会，简化操作方法。针对这些问题，本专利技术应用核酸释放剂快速获得肝炎病毒的核酸，实现一步法和一管法完成荧光快速定量检测过程，并采用竞争性内标和防污染系统降低假阳性和假阴性，大大提高了检测效率，灵敏度和准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种。一种快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品和内标，所述核酸释放试剂为SDS、3-丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为O. 25% SDS、O.25% Chaps,5% (NH4) 2S04、I % 甲酰胺，余量为水。所述标准品为为非感染性肝炎病毒DNA或RNA ;所述对照品为阴性对照为无菌双蒸水，阳性对照为非感染性肝炎病毒DNA或RNA。所述核酸扩增试剂为I. 5-5mM 的 MgCl2, 20_50mM Tris-HCl, pH8. 3-8. 5，35_75mM的 KC1，2. 5-4mM 的 dNTP, I. 25-5U Taq 酶，0· 1-0. 5U UNG 酶，50_200nM 探针，50_200nM 内标探针，50-750nM肝炎病毒上下游引物。所述模板为DNA时，酶混合液为Taq酶5U和UDG酶O. 5U ;模板为RNA时，酶混合液为Taq酶5U、UDG酶O. 5U和反转录酶100U。所述dNTPs 的组成比例为dATP dCTP dGTP dUTP = I : I : I : I : 2(体积比);所述的PCR增强剂为O. I 5mg/mlBSA, 5 500mmo 1/L海藻糖,0. I 5MBetaine和O. 01 % I %明胶的混合水溶液。所述肝炎病毒为乙肝HBV时。探针5，TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG，3上游引物5，ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3； 下游引物5’ AGCGCCGACGGGACGTAGAC，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品和内标，其特征在于：所述核酸释放试剂为SDS、3？[3？(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)2SO4、1％甲酰胺，余量为水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李望丰，李静芝，周凯，许守民，刘立侠，
申请(专利权)人：东北制药集团辽宁生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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