丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述的试剂盒包括：荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述荧光定量反应液包括含有检测HCV?RNA的引物和探针序列的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ?ID?NO:1，反向引物序列为SEQ?ID?NO:2，荧光探针序列为SEQID?NO:3，其5′端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述阳性对照样品为包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。本发明专利技术提供了一种能快速、准确、高敏感度的检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及ー种快速定量检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
丙型肝炎病毒(!fepatitis C virus, HCV)是ー种有包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，呈球形，直径小于80mm,其基因组总长约9. 6kb,包含ー开放的阅读框(0RF)，后者经翻译成一个大的多蛋白前体(约3000个氨基酸)，并在翻译的同时和翻译后由宿主细胞的信号肽酶和HCV自身编码的蛋白酶加工成约10个成熟的HCV蛋白(包括结构蛋白及非结构蛋白)。全球丙型肝炎的感染率为3%，估计约有I. 7 2. O亿人感染HCV, HCV感染可导致慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的发生。随着分子生物学与流行病学的 发展，国内外研究已证实，丙型肝炎是肝细胞肝癌(Hapatitis C carcinoma, HCC)的重要病因，其中约有509Γ80%急性感染者转变为慢性，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌，成为威胁人类健康的重要因素。在我国一般人群抗HCV阳性率为3.2%，丙型肝炎患者约4000万，即每30个人中就有一名丙肝患者。丙型肝炎是ー种严重危害人体健康的传染病，目前尚无有效的治疗措施，因此，早期发现丙型肝炎患者、及时治疗已成为阻断丙型肝炎传播的重要手段。血清HCV RNA阳性是HCV感染的直接依据，HCV RNA载量反映了病毒复制的活跃程度和患者病程变化，一般在HCV感染后2飞周的血清中即可检出，是丙型肝炎的诊断和衡量抗病毒疗效的重要指标。我国目前应用的HCV RNA检测主要以国产试剂盒为主，其最低检测值为lX103IU/ml，与同类进ロ试剂盒相比，敏感性过低，给准确判定临床治疗效果带来一定影响。因此，研究检测HCVRNA的载量具有重要的理论价值及临床意义。目前最常见的HCV基因检测方法主要有定量逆转录ー聚合酶链反应(RT— PCR)和分支 DNA 检测(branched DNA, bDNA)。RT — PCR检测血清中的HCV RNA，基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的⑶NA，再通过PCR将⑶NA扩增，电泳后确证結果。此法可以扩增极微量HCV RNA，具有早期、敏感和特异等特点；它的引物均根据HCV基因5’端保守区域设计，但是由于引物选择的位置及方法学上的差异HCV RNA的检测结果出入较大，往往无法应用于大規模的人群筛检，常出现假阳性或假阴性的結果，且费时，检出率较低，难以在常规工作或基层实验室推广普及应用。bDNA是ー种核酸检测技木，属于信号扩增，是把HCV基因组通过特异性“捕获”探针固定在微孔板上，带有bDNA多聚物的病毒特异性延伸探针与固定的病毒核酸結合，bDNA多聚物上带有寡核苷酸的重复结合位点，结合的寡核苷酸偶联的酶催化荧光底物产生荧光信号，測定信号的強弱判断样品中HCVRNA的量。检测限为615IU/ml，特异性达到96. 0%-98. 8%，降低了污染机会，具有较高的重复性，但敏感性不高。此外，利用分子杂交直接检测HCV RNA也是ー种较为特异敏感的方法，但不如PCR法灵敏，且操作繁琐，即采用与HCV RNA互补的cDNA探针进行斑点杂交来直接检测血浆中的HCV RNA0基因芯片技术检测HCV RNA :由于该技术较为复杂，且成本较高，目前对其应用仍大多停留在实验阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。最新出现的实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。RT-PCR和bDNA技术，均无法像荧光定量PCR那样基本上满足上述所有的条件。与荧光定量PCR相比，这两种检测方法的敏感性低，且线性范围窄。而全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技木。实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是ー种在PCR扩增时在加入ー对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和ー个淬灭突光基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增吋，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同歩。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。本专利技术中的试剂盒是针对HCV RNA检测而设计的，建立定量检测血清中丙型肝炎病毒的实时荧光定量PCR体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种能快速、准确、高敏感度的检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。荧光定量反应液用于检测HCV RNA，其反应体系包括检测HCV RNA的引物和探针序列正向引物序列(HCV-ForwardPrimer)为SEQ ID NO: I (5’-TGCTCATGTTGCACGGTCTAC-3’)；反向引物序列(HCV-ReversePrimer)为SEQ ID NO: 2 (5’ -TCTGCGGAACCGGTGAGT-3’)；突光探针序列(HCV-Taqman-Probe)为SEQ ID NO: 3 (5 ’ -FAM-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-TAMRA-3 ’ )；该荧光探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3，端标记TAMRA荧光淬灭基团。阳性对照样品包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的原理为采用荧光定量PCR方法对丙型肝炎病毒进行定量检测。首先经逆转录酶作用，将HCV RNA逆转录为单链的cDNA，针对丙型肝炎病毒基因序列特异设计TaqMan探针及引物一対，当遇到丙型肝炎病毒特定基因序列吋，TaqMan探针可与之完全結合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测丙型肝炎病毒含量的目的。本专利技术提供的两端都标有突光发光基团的特异性突光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括：荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于：所述荧光定量反应液包括含有检测HCV？RNA的引物和探针序列的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ？ID？NO:1，反向引物序列为SEQ？ID？NO:2，荧光探针序列为SEQ？ID？NO:3，其5′端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述阳性对照样品为包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：广州达健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：