本发明专利技术提供了一种柯萨奇病毒A4核酸检测用引物、探针及试剂盒，所述引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?No:1和SEQ?ID?No:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ?ID?No:3所示。所述试剂盒包括所述正向引物和反向引物。本发明专利技术所设计的引物特异性好，灵敏度高，用本发明专利技术引物及探针，通过RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A4，而且检测准确性高、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测技术，具体地说涉及柯萨奇病毒A4核酸检测用引物、探针及试剂盒。
技术介绍
柯萨奇病毒A4 (coxsackievirus A4,简称CVA4)为单股正链RNA病毒，属小RNA病毒科(Picoranviridae),根据其分子遗传特征，CVA4属于人类肠道病毒A类(humanenterovirus A,简称HEV-A)。CVA4作为人类感染性疾病的一种病原,能引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡、类感冒发热疾病、心肌心包炎及急性肠道感染性疾病等。近些年爆发的手足口病的病原学调查显示，除主要病原体人类肠道病毒71 (human enterovirus 7LHEV71)外，还有多种HEV-A参与感染，其中CVA4就是常见的一种。并且，最近韩国爆发的心肌心包炎、俄罗斯的急性肠道感染性疾病病原学调查以及中国的手足口病的病原学调查发现都与CVA4有关。CVA 4的感染一年四季均可发生，其主要通过粪-口途径在人群中传播,带毒的粪便可通过污染的手、餐具、食物经口进入人体，咳嗽、打喷嚏形成的飞沫可直接或间接进行传播，另外，接触病人破溃的疱疹液等也受到感染。CVA 4作为一种潜在的威胁，为了更好地应对CVA4的感染所引发的疾病流行，提供一种快速、准确的检测技术显的尤为重要。本专利技术选择柯萨奇病毒A4的VPl基因设计用于荧光RT-PCR检测的引物及探针序列，建立了柯萨奇病毒A4荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否感染柯萨奇病毒A4。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于柯萨奇病毒A4实时荧光RT-PCR检测的引物、探针及试剂盒。本专利技术在分析已报道的柯萨奇病毒A4VP1基因序列基础上，分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID No:l和SEQIDNo: 2 所示。本专利技术设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该探针一端标记有报告荧光基团，另一端标记有淬灭荧光基团。其中，报告荧光基团可以采用下列荧光基团中的任意一种FAM、HEX、TET、J0E、R0X和 CY5，淬灭荧光基团可以采用下列荧光基团中的任意一种TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2 和 BHQ3。根据TaqMan技术,在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个突光基团的核苷酸探针，例如将报告荧光基团标记在探针的5’端，淬灭荧光基团标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光基团所发射的荧光可被淬灭荧光基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光基团信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光基团的抑制作用消失，报告荧光基团信号增强，从而实现对柯萨奇病毒A4核酸的实时检测。本专利技术提供的试剂盒，包括上述正向弓丨物和反向引物。优选地,试剂盒还包括上述探针。优选地，试剂盒还包括实时荧光RT-PCR反应液，与所述正向引物、反向引物和探针共同构成实时荧光RT-PCR检测体系，2 5 μ I所述实时荧光RT-PCR检测体系的配置为2X0neSt印RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M所述正向引物2 μ 1，10 μ M所述反向引物2 μ 1,10 μ M 所述探针 I μ I, 5U/μ I Ex Taq HS O. 5 μ 1,40U/ μ I PrimeScript RT enzymeMix O. 5 μ I, RNA5 μ I, RNase Free dH20 I. 5 μ I。优选地，试剂盒的检测反应条件为42°C反转录25min，95°C变性15s，以95°C 10s，53 °C Imin扩增45个循环。 当然，可以根据本专利技术给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。本专利技术根据柯萨奇病毒A4VP1基因序列设计引物及荧光探针，该引物特异性强，用于荧光PCR检测的灵敏度高。用本专利技术引物及探针，通过RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A4,而且检测准确性高、灵敏度高，因此能够为柯萨奇病毒A4感染的相关疾病诊断提供科学依据。附图说明图I是实时荧光RT-PCR技术柯萨奇病毒A4核酸检测的特异性实验的检测结果图；图2是本专利技术检测方法的灵敏度实验的检测结果图。具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术的范围。实施例I :引物及探针的设计和合成比对并分析GenBank中分离自全球的柯萨奇病毒A4的同源VPl基因序列,利用生物软件01igo7. O分别在其保守位点设计引物和Taqman探针,利用在线的OligoAnalyzer3. I分析其Hairpin, Self-Dimer和Δ G值,并通过NCBI数据库的Blast程序进行特异性验证。所设计的引物及探针序列为CVA4-F325 (正向引物)5’ -TGGGATATTGACATCATGGCGTT-3，；即 SEQ ID No: ICVA4-R469 (反向引物)5’ -GCACATACATGTATTGGATCACACT-3’ ；即 SEQ IDNo: 2CVA4-P367(探针)5，-FAM-CTTGAGGCATTCACATACATGCG-TAMRA-3，；即 SEQ ID No:3,该探针的5’端标记有报告荧光基团FAM，3’端标记有淬灭荧光基团TAMRA。实施例2 =RNA的提取以粪便样品为例在抽提前加O. OlM PBS,PH7. 5，其中，O. 5g粪便样品(O. 5ml液态粪便)加5mL PBS，振荡混匀后将悬液1500 Xg离心20min，取上清液进行RNA抽提。病毒样品RNA的抽提使用High Pure Viral RNA Kit (Roche, Germany),步骤按其操作说明书进行，具体的操作步骤如下I)向200 μ I的上清液中加入400 μ I的Binging Buffer,混匀后将混合液转入装有过滤管的收集管，8000 Xg离心15s ；2)将过滤管置于新的收集管中，向滤管中加500 μ I Inhibitor Removal Buffer,8000 X g 离心 Imin ；3)将过滤管置于新的收集管中，向滤管中加450 μ I Wash Buffer，8000X g离心Imin ；4)将过滤管置于新的收集管中，再一次向滤管中加450 μ I Wash Buffer, 8000X g离心Imin ；5)将过滤管置于新的收集管中，9300 Xg离心15s ；·6)将过滤管置于新的离心管中，向离心管中加入50μ I的Elution Buffer,8000 X g离心Imin从而得到纯净的病毒RNA，提取的RNA于_80°C保存。实施例3 :Real-timeRT-PCR扩增方法的建立I、实时荧光RT-PCR反应体系以RNA为摸板，进行实时RT-PCR反应(反应用试剂购自TaKaRa)。荧光定量RT-PCR反应体系如下表 _m>_25μ1体积终浓度 2><One Step RT-PCR Buffer12,5μ1 Η向弓I物和反財I物(IO μΜ)各2μ1各0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柯萨奇病毒A4核酸检测用引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？No:1和SEQ？ID？No:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何雅青，陈龙，
申请(专利权)人：何雅青，陈龙，
类型：发明
国别省市：
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