本发明专利技术提供了一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒，所述引物包括特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物，所述探针包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的三条特异性检测探针，试剂盒包括所述三对引物以及用所述三条特异性检测探针与荧光编码微球进行偶联制成的特异性检测微球混合物。经实验证明，利用本发明专利技术引物和探针通过多重PCR结合液相芯片检测的方法，能够同时对A型轮状病毒和诺如病毒GI型、GII型进行准确地检测，而且特异性强、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测技术，特别是轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒。
技术介绍
急性腹泻是一个全球性的严重的公共卫生问题，在儿童的发病率仅次于呼吸道感染，列为第二位。在发展中国家5岁以下儿童尤为突出，其年发病率为2. 2次。全世界每年发生30-50亿例病例，其中500-1000万例死亡，其病原有细菌、病毒及原虫等，以病毒最为严重。A组轮状病毒是儿童重症胃肠炎(腹泻)主要病原，占腹泻住院儿童中的20-60%。轮状病毒(rotavirus，RV)为呼肠病毒科轮状病毒属病毒。病毒体呈圆球形，有双层衣壳，每层衣壳呈二十面体对称。病毒体的核心为双股RNA，由11个不连续的节段组成。每一个片段各编码1种蛋白，VPl 4，VP6和VP7 6种结构蛋白，其中VP4经胰蛋白酶裂解可产生具有增强病毒感染性的VP5和VP8 ；5种非结构蛋白为NSPl NSP5。根据内层壳衣中VP6蛋白上抗原的差异，RV被分为A，B, C，D，E，F，G七组，其中A群为主要引起婴幼儿腹泻。诺如病毒(Noruvirus，简称NoV)的感染是引起成人腹泻的重要病因，广泛地分布于全世界。该类病毒常常可以引起成人和年长儿童肠炎的暴发流行，也是食物集体中毒最主要的病毒，占腹泻住院儿童中的5-15%。根据NoV RNA多聚酶和衣壳蛋白区核苷酸序列的相似性，将NoV分为5个组GI、Gil、GIII、GIV、GV。感染人的NoV包括G I、G II和 GIV0近年来，变异株GII4在芬兰、挪威、荷兰、澳大利亚、日本、台湾和香港出现，且逐渐成为流行的优势株；一些国家和地区还发现NoV的重组株。腹泻病毒的检测方法主要包括电镜、病毒分离鉴定、血清分型、中和抗体、RT-PCR 和核苷酸序列分析。但目前，除RT-PCR、real time PCR技术外，尚缺乏快速敏感的诊断方法。轮状病毒较难培养，且实验周期长，操作比较复杂，不利于推广。NoV原型株不能用细胞株培养，也不能建立动物模型，传统的检测方法不能检测出食品或水标本中较低浓度的病毒；由于不同株间壳衣蛋白抗原具有相当大的变异性，因此酶联免疫吸附法(ELISA)的应用也受到了限制。目前，轮状病毒和诺如病毒的检测手段主要采用分子生物学诊断技术。聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于病毒特异性基因的检测，尽管它也具有灵敏、特异的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了 PCR的高灵敏性，DNA杂交的高特异性，光谱技术的精确定量等多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机会大大降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测，且实验成功的难度极大。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出一个或多个核酸片段的PCR反应。多重PCR主要用于多种病原体(病原菌、致病病毒)的同时检测或鉴定、某些遗传病及基因的分型检测鉴定。 多重PCR的特点有1)高效性，能在同一 PCR反应管内同时检出多个靶基因，为临床提供更多更准确的诊断信息；2)经济性，在同一反应管内同时检出多个靶基因，节省试剂，节约经费开支；3)简便性，在同一反应管内同时检测多个靶基因，一次操作即可完成多个靶基因检测，将大大的节省时间和劳动。液相芯片技术是一种新型检测平台，将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，利用其多达100种荧光编码微球，可以标记上100种不同的探针分子，可同时对一个标本中的100种不同的目的分子进行检测。液相芯片检测时先后加入样品和报告分子与标记的荧光编码微球反应，样品中的目的分子(PCR扩增产物)能够与探针和报告分子特异性结合，从而使标记的荧光编码微球携带上报告分子链霉素-藻红蛋白，随后利用仪器对荧光编码微球进行检测和结果分析。液相芯片技术采用微流技术使荧光编码微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型(即定性);绿色激光可确定微球上结合的报告分子的数量，从而确定微球上集合的目的分子的数量(即定量)。 通过红绿双色激光的同时检测，可完成对反应的实时、定性和定量分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用的引物、探针及试剂盒，使得能够通过采用多重PCR结合液相芯片检测的方法，在一次检测中，准确地完成A型轮状病毒(简写为HRV-A)、GI型诺如病毒(简写为NoV GI)和GII型诺如病毒(简写为NoV GII)的检测。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物，其特征在于包括特异性扩增A 型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO: IiPSEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3 禾口 SEQ ID NO:4、及 SEQ ID NO: 5 禾口 SEQ ID NO:6 所示， 其中碱基序列为SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:6的引物的5’端带Biotin标记。一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用探针，与上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物配套使用，包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的特异性检测探针，其碱基序列分别如SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示，探针的 5，端带NH2标记。本专利技术还提供了一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒，包括上述特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物。本专利技术轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒的一种优选方案中，还包括用上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用探针与荧光编码微球进行偶联制成的特异性检测微球混合物。上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒还可以包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒阳性标准品，它们分别是用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2, SEQID N0:7禾口 SEQ ID NO:8、SEQ ID N0:9禾口 SEQ ID NO: 10所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒。用上述液相芯片试剂盒检测A型轮状病毒、诺如病毒GI型和GII型的过程为用 SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4、及SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6 所示的三对引物制成混合引物工作液，构建多重PCR反应体系，对待检样品进行PCR扩增， 并将设计的每种特异性检测探针与相应荧光编码的微球进行偶联制成特异性检测微球并混合制成微球混合物，然后先后将多重PCR扩增后的产物和报告分子加入制得的微球混合物进行反应，最后将反应液通过液相芯片检测仪(如Lum本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物，其特征在于：包括特异性扩增Ａ型轮状病毒、ＧＩ型诺如病毒和ＧＩＩ型诺如病毒序列的三对引物，其碱基序列分别如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６所示，其中碱基序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６的引物的５’端带Ｂｉｏｔｉｎ标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何雅青，胡春凌，汪朝晖，
申请(专利权)人：何雅青，胡春凌，汪朝晖，
类型：发明
国别省市：94
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