本发明专利技术涉及一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物、探针及分子检测方法。所述的引物和探针如SEQ?ID?NO.1-4所示。所述分子检测方法是用上述引物和探针对核酸样品进行PCR扩增，根据PCR过程中荧光强度的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带，对核酸样品进行定量或/和分型。使用本发明专利技术可以方便、有效地监控在样品采集、运输、保存、提取等任何环节出现的潜在问题，为提高PCR的可信度、降低其假阴性报告率等提供技术支持。
【技术实现步骤摘要】
—种用于晡乳动物核酸样品质量控制的弓丨物、探针及分子检测方法
本专利技术建立了一套基于羟甲基胆色烷合成酶基因、适用于所用哺乳动物PCR质量控制的内源基因系统。该系统能高度敏感、特异地扩增来自9个国家(津巴布韦，尼加拉瓜，哥斯达尼加，多米尼格，格林纳达，蒙特塞拉特，尼维斯，圣基茨，中国)的、人和12种哺乳动物(猴，猫，狗，牛，驴，山羊，绵羊，马，豹子，狮子，猪和老虎)的核酸、二种小鼠品系的11种组织器官(心脏、肝脏、脑、脾脏、肺脏、脂肪、肾脏、肌肉、毛发、骨、皮肤)的核酸，而不扩增细菌、寄生虫、病毒、食用植物油的核酸。此外，本专利技术设计的扩增片断包含的一段基因序列区，所有哺乳动物在该区有显著差异，测序此区可快速方便地鉴定哺乳动物的种类。
技术介绍
PCR技术自1986年专利技术以来，已经被广泛地应用于医学、生物学和农业科学等各个领域，由于其无与伦比的高度特异性和敏感性，PCR技术成为现代分子检测学的必不可少的核心组成部分。而PCR结果的可信性很大程度上依赖于待检样品的核酸水平和质量。影响最终待检样品中核酸的质量和水平的因素包括:1)样品采集。采集的样品中目的核酸的含量、样品的采集过程以及采集缓冲液和抗凝剂的选择；2)样品的储存和运输。样品的不科学的储存和处理、反复冻融、溶血等会引起核酸的降解；3)样品的核酸提纯。不恰当的核酸提纯方式、残留PCR抑制剂等都会影响样品的质量。为此，科学家们成功地建立了一种在样品中添加外部控制基因的办法来监控待检样品核酸提纯效率等而确保PCR的可信度。然而，加入外源性控制基因的手段不能监控样品采集、运输、保存等环节上出现的核酸降解和污染等问题。目前世界范围内，还没有一个全程监控待检样品的核酸水平和质量并方便地用于PCR质量控制的系统。因此，亟需建立一种能够有效及全程地监控从样品采集到核酸提纯等环节的质量控制系统，从而确保PCR结果的可信度。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供一种基于羟甲基胆色烷合成酶基因的哺乳动物核酸定量和分型的分子检测方法，使用本专利技术可以方便、有效地监控在样品采集、运输、保存、提取等任何环节出现的潜在问题，为提高PCR的可信度、降低其假阴性报告率等提供技术支持。本专利技术的原理和最核心的思路是专利技术一种高度灵敏的、可以用于任何哺乳动物PCR系统的外源性基因控制系统。确保此系统不扩增非哺乳动物以外的核酸，如细菌、病毒、寄生虫和植物等。本专利技术选择了一个相对保守的看家基因(羟甲基胆色烷合成酶)作为目标基因，此基因主要存在于哺乳动物，而不存在于植物和细菌等微生物。总体的思路是:巧妙地设计一对引物和探针，特异地扩增所有哺乳动物的核酸；此PCR扩增产物的羟甲基胆色烷合成酶基因在哺乳动物中高度多样性的区域(90个核酸在哺乳动物中的相似率仅为19%，图1)。因此，PCR扩增后对PCR扩增产物进行基因测序可以方便地确定哺乳动物的种类；此设计测试不同种类和来源的核酸样品，而保证其高度的特异性和敏感性。从GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)获取如下轻甲基胆色烧合成酶基因的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对(如图1所示):人:NG_008093,猴子:NC_007871,狗:NC006587,猫:NC_018732,牛:AC000712,羊:NC019472,猪:NC_010451,马:NC_009150,小鼠:NC_000075，大鼠:NC_005107。据此，本专利技术设计的引物和探针为:上游引物-1:5’ -TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3，(SEQ ID N0.1)上游引物-2:5’-GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3’ (SEQ ID N0.2)6-FAM 探针:5，-AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’ (SEQ ID N0.3)LCRed640 探针:5’ -LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate_3’ (SEQ IDN0.4)。 本专利技术还公开了用于哺乳动物核酸样品质量控制分子检测方法，即用上述引物和探针对核酸样品进行PCR扩增，根据PCR过程中荧光强度的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带大小，对核酸样品进行定量或/和分型。所述的定量，是合成羟甲基胆色烷合成酶基因的代表序列，计算其所含的基因拷贝的绝对数目而制备成一系列不同拷贝数的标准品，在同一系统扩增标准品和样品核酸，根据标准品产生的标准曲线对样品核酸进行精确定量。由于本专利技术的PCR扩增产物包含一段在所有哺乳动物中高度多样性的区域。因此，PCR扩增后对PCR扩增产物进行基因测序后，与GenBank中的羟甲基胆色烷合成酶基因标准序列进行比对可以确定哺乳动物的种类。羟甲基胆色烷合成酶-PCR (HMBS-PCR)特异性的确定。本专利技术的特异性从五个方面得到保证:I)设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本专利技术设计的弓丨物能特异地扩增哺乳动物，而不扩增其它非哺乳动物的核酸。同时，通过BLAST确认，一对上下游引物和二个探针能特异地扩增和检测所有的哺乳动物核酸；2)本专利技术特异敏感地检测人和12种哺乳动物的血液核酸，而不扩增其它非哺乳动物(如细菌、植物食用油、寄生虫)的核酸；3)本专利技术检测小鼠的11种器官和组织的核酸，保证此基因在不同组织器官均表达，而且此基因拷贝数在不同小鼠品系、性别和组织器官无明显差异；4)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(640nm)的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的176bp的条带；5)对扩增的176bp的PCR产物进行测序，测序的结果和GenBank中的羟甲基胆色烷合成酶基因标准序列进行比对。羟甲基胆色烷合成酶-PCR灵敏度的确定:由IDT合成羟甲基胆色烷合成酶基因的代表序列。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每IOul合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的基因。用本专利技术系统扩增含不同基因浓度，来确定本专利技术检测此基因的灵敏度。此外，50微升的小鼠血液用于核酸提纯，然后10倍稀释，用于本专利技术的PCR测定。结果显示，此专利技术的单个反应系统可以扩增0.5nl小鼠血液DNA，这等同于一个反应系统中5个拷贝的羟甲基胆色烷合成酶基因(图3)。上述确定敏感性的标准品系统(每IOiU合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的基因)会产生一个标准曲线的几何公式。使用本专利技术同时扩增标准品系统和样品核酸，由标准品系统产生的标准曲线可以精确的决定样品核酸的浓度，用于精确的定量。在各个行业、大学、研究所、研发机构、检测中心等，PCR都是必不可少的手段。绝大多数这些研究都是和哺乳动物样品相关。本专利技术将是世界范围内，第一个通用的、检测样品采集、运输、储存、核酸提取全过程的质量控制系统，本专利技术专利将会产生理想的经济效益。【附图说明】本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针如下：上游引物?1：???????5’?TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT?3’上游引物?2：???????5’?GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT?3’6?FAM探针：????????5’?AGCAHGAAGATGGYCCWGA?6?FAM?3’LCRed640探针：?????5’?LCRED640?GATGAYCCACAGCTGGTRG?Phosphate?3’。
【技术特征摘要】
1.一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针如下: 上游引物-1:5’ -TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3’ 上游引物-2:5 ’ -GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3， 6-FAM 探针:5’ -AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’ LCRed640 探针: 5’ -LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate_3’。2.一种用于哺乳动物核酸样品质量控制分子检测方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成明，危蓝菁，张继垒，杨奕，张真稳，郁多男，陶建平，杨章平，郝永清，徐达，陆光武，庄林林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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