The invention discloses an asymmetric AS2 PCR gene mutation detection method based on, comprising the following steps: 1) extracting DNA samples; 2) amplified gene fragments to be tested; 3) the PCR products added to the asymmetric AS2 PCR reaction system, PCR amplification reaction and probe digestion reaction; general label signal probe, AS2 the PCR reaction system containing 2 bands of fluorescence labeled 2 forward primers, 1 reverse primers, exo activity polymerase and PCR buffer; 4) fluorescence signal detection reaction Ct, calculating the difference between the two channels, and determine the gene SNP of tested according to Ct difference. The present invention also discloses the method for asymmetric AS2 PCR oligonucleotide primers group and its use. The present invention by primer design asymmetric AS2 PCR, overcome the false positive rate of the traditional AS2 PCR high, improve the accuracy of gene mutation detection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA检测
,特别是涉及组织、血液中的DNA位点突变检测,更具体地说,是涉及用不对称AS2-PCR实时、定点检测基因变异的方法,以及该方法所用的引物。
技术介绍
基因科学是生物科学的一个重要领域,生命体的基因密码序列及其变异会影响生命体的多种生物功能和功能变异,通过检测基因SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性),可以了解和预估生命体的功能变异。当前,检测基因SNP已成为分析判断遗传病、药物反应特征的重要手段,也是预测和预防许多生命疾病的重要手段,例如,糖尿病等内分泌疾病,以及各种肿瘤的易感因素。目前,基因SNP的检测方法主要有毛细管电泳测序法、Taqman探针法、等位基因特异PCR法(AS2PCR)和通用探针实时荧光PCR。毛细管电泳测序法是基因变异检测的经典可靠方法,但需要使用昂贵的测序仪,检测成本较高,而且测序仪的操作使用和维护都比较复杂,因此大多数城市的医院和科研单位都没有配备测序仪。Taqman探针法也是一种经典方法。Taqman探针法以两条15—25bp的探针片段中的1个碱基的微小杂交温度差异来鉴定目标位点的一个碱基的差异,这种方法的缺点是:1)探针的筛选比较困难,一般一对探针需要经过多次筛选,才能选出较为合适的探针,而且经常遇到多次筛选不成功的情况;2)检测一个基因的SNP需要两个特异探针,因此成本较高;3)不是定点识别,因此对单碱基突变检测的灵敏性和特异性不高,容易出现假阴性或假阳性。等位基因特异PCR法(AS2-PCR),经过人们改良后,其非特异性扩增有所降低,但PCR产物的 ...
【技术保护点】
基于不对称AS2‑PCR的基因变异检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)提取样本DNA;2)以所述DNA为模板,扩增待测基因片段;3)将步骤2)的产物加入到不对称AS2‑PCR反应体系中,进行AS2‑PCR扩增反应和探针外切反应;所述AS2‑PCR反应体系含有2条带荧光标记的通用标签信号探针、2条AS2‑PCR正向引物、1条AS2‑PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR缓冲液;所述AS2‑PCR反向引物的量多于所述AS2‑PCR正向引物的量;4)检测步骤3)的反应产生的荧光信号,计算两个通道的Ct值和Ct差值,根据Ct差值判断待测基因的SNP。
【技术特征摘要】
1.基于不对称AS2-PCR的基因变异检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)提取样本DNA;2)以所述DNA为模板,扩增待测基因片段;3)将步骤2)的产物加入到不对称AS2-PCR反应体系中,进行AS2-PCR扩增反应和探针外切反应;所述AS2-PCR反应体系含有2条带荧光标记的通用标签信号探针、2条AS2-PCR正向引物、1条AS2-PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR缓冲液;所述AS2-PCR反向引物的量多于所述AS2-PCR正向引物的量;4)检测步骤3)的反应产生的荧光信号,计算两个通道的Ct值和Ct差值,根据Ct差值判断待测基因的SNP。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3),每条AS2-PCR正向引物包括天然特异序列区段、标签信号序列发生区段和酶结合点发生区段,所述标签信号序列发生区段的序列与所述通用标签信号探针的序列完全相同。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述天然特异序列区段靠近3’端,序列长度为18~28bp;所述标签信号序列发生区段位于中间,序列长度为15~25bp;所述酶结合点发生区段靠近5’端,序列长度为5~25bp;所述通用标签信号探针的序列长度为15~25bp,一端标记荧光基团,另一端标记MGB。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述酶结合点发生区段GC含量为0~30%。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3),每条AS2-PCR...
【专利技术属性】
技术研发人员:黄新华,戴慧清,李冰,
申请(专利权)人:上海基致生物医药科技有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。