一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，该方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建前的目标区域捕获，整个目标区域捕获过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台和其他建库通用型试剂盒可以十分有效的解决目前对于临床上胃肠道间质瘤中在少量的临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉，可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法及应用，尤其涉及一种用于高通量测序检测胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法及其试剂盒与应用。
技术介绍
胃肠道间质瘤(GastrointestinalStromalTumors,GIST)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，占胃肠道恶性肿瘤的1～3％，估计年发病率约为10－20/100万，多发于中老年患者，40岁以下患者少见，男女发病率无明显差异。研究发现GIST发生主要与c-KIT基因突变导致酪氨酸激酶持续活化使突变细胞增殖失控有关。80％-88％GIST的发生源于c-KIT基因功能获得性突变。c-KIT突变多表现在外显子11、9、13或17。c-KIT基因突变位点与分子靶向药物格列卫疗效相关，第11外显子突变疗效好，第9外显子中度敏感，第13和17外显子突变疗效差。2003年Heinrich等在c-KIT突变阴性的GIST中发现了血小板生长因子受体a(PDGFRA)的表达即CD34+，是GIST发生的另一种重要原因。PDGFR-a的基因定位于人染色体4q11-21与c-KIT基因突变连锁，属酪氨酸蛋白激酶家族。近35％c-KIT突变阴性的GlST存在PDGFR-a基因的活化突变，主要发生在外显子12、18及9。PDGFR-a第18外显子突变对分子靶向药物格列卫原发耐药，因此，临床指南中已推荐常规工作中需检测GIST的KIT基因第9，11，13，17和PDGFRA基因第12和18外显子，以协助临床治疗。因仅检测6个外显子，所以采用的方法为PCR-直接测序法。就在近年，在c-KIT和PDGFR-a基因均无突变的GIST，即野生型GIST中，获得重要发现，约40％存在TP53基因突变，19.86％的NF1基因突变，19.86％的ATRX基因突变，5％存在NF1基因突变，5％存在SDH基因突变，5％存在B-raf基因突变。这些突变也具有预后和疗效预测价值。因此，胃肠道间质瘤是一种涉及多种基因突变的疾病，其诊断需要依靠基因突变类型的检测。目前，基因突变的检测主要依靠PCR-直接测序法，但PCR-直接测序法一次PCR反应只能扩增一对引物，耗时长，且测序敏感度低，只能检测到10％频率以上的突变。目前要求胃肠间质瘤除检测KIT和PDGFRA外，还需要检测更多基因和更多靶点，涉及80个热突变位点，继续使用PCR-直接测序法，劳动量大，操作繁琐，敏感度低，也是实际工作中不能完成的。因此，本领域的技术人员致力于开发一种可以一次性检测多个基因、多个位点的新方法。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术提供了一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其中a.所述文库包括人类基因c-KIT、PDGFRA、B-raf、K-ras、N-ras、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、NF1、TP53、VEGFR2(KDR)、ATM、IGF1R和ATRX中的每个基因的至少一个突变；b.所述构建方法包括步骤：1)针对每个突变设计一对基本扩增引物组成基本扩增引物组，且正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；2)对目标区域进行PCR富集反应；3)将扩增产物纯化后即得所述胃肠道间质瘤多基因变异文库。优选地，步骤1)中所述基本扩增引物组的正向引物和反向引物的Tm值为60±2℃。进一步，步骤1)中所述基本扩增引物组中的正向引物和反向引物的序列选自表1所列引物对：表1进一步，本专利技术可用于各种组织样本，采用常规DNA提取试剂盒提取基因组DNA；优选地，本专利技术采用石蜡组织样本提取基因组DNA，并优选使用Qiagen公司石蜡组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。优选地，步骤2)中所述PCR富集反应采用多个靶序列在单管中富集的方式进行。进一步，步骤2)中所述PCR富集反应的体系中须加入RingCap-Taq酶，该酶是由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；优选地，三种酶的组成比例为1:1:1。优选地，步骤2)中所述PCR富集反应的体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5μL，其余组分如表2所示：表2优选地，步骤2)中所述PCR富集反应的扩增程序如表3所示：表3优选地，步骤3)中所述扩增产物纯化采用磁珠法，具体优选为使用AgencourtAMPureXP试剂进行纯化。在本专利技术的较佳实施方式中，DNA富集反应基本扩增引物组包括表1所列的所有引物，且其配方如表4所示：表4进一步，本专利技术制备的胃肠道间质瘤多基因变异文库可通过IontorrentPGM高通量测序仪/或illumina高通量测序仪进行文库上机检测，获得目标序列信息，通过VC软件进行数据信息比对分析，得到样本突变状态。本专利技术制备的胃肠道间质瘤多基因变异文库还可进一步通过PCR富集反应引入Barcodel接头。本专利技术还提供了一种用于胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建的试剂盒，包括：针对人类基因c-KIT、PDGFRA、B-raf、K-ras、N-ras、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、NF1、TP53、VEGFR2、ATM、IGF1R和ATRX中的每个基因的至少一个突变设计的基本扩增引物组、由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成的RingCap-Taq酶、RingCap缓冲液、PCR反应常规试剂；其中Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶的组成比例为1:1:1。优选地，所述用于胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建的试剂盒还包括AgencourtAMPureXP试剂。本专利技术提供的胃肠道间质瘤多基因变异文库构建方法及其构建的胃肠道间质瘤多基因变异文库可用于高通量测序检测胃肠道间质瘤基因的突变，此外还可应用于基因芯片平台、杂交检测平台等相关
本专利技术具有以下有益效果：A.本专利技术的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建前的目标区域捕获，整个目标区域捕获过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台和其他建库通用型试剂盒可以十分有效的解决目前对于临床上胃肠道间质瘤中在少量的临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。B.本专利技术的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1为本专利技术的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图；图2为本专利技术的实施例检测胃肠道间质瘤多基因突变的检测均一性结果图。具体实施方式本实施例采用100份胃肠道间质瘤石蜡组织样品进行多基因变异文库的构建及检测。使用Qiagen公司石蜡组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取石蜡切片5片。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH8.0)调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR扩增的模板。本实施例中PCR富本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其特征在于a.所述文库包括人类基因c‑KIT、PDGFRA、B‑raf、K‑ras、N‑ras、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、NF1、TP53、VEGFR2、ATM、IGF1R和ATRX中的每个基因的至少一个突变；b.所述构建方法包括步骤：1)针对每个突变设计一对基本扩增引物组成基本扩增引物组，且正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；2)对目标区域进行PCR富集反应；3)将扩增产物纯化后即得所述胃肠道间质瘤多基因变异文库。

【技术特征摘要】
1.一种胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其特征在于a.所述文库包括人类基因c-KIT、PDGFRA、B-raf、K-ras、N-ras、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、NF1、TP53、VEGFR2、ATM、IGF1R和ATRX中的每个基因的至少一个突变；b.所述构建方法包括步骤：1)针对每个突变设计一对基本扩增引物组成基本扩增引物组，且正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；2)对目标区域进行PCR富集反应；3)将扩增产物纯化后即得所述胃肠道间质瘤多基因变异文库。2.如权利要求1所述的胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其特征在于步骤1)中所述基本扩增引物组的正向引物和反向引物的Tm值为60±2℃。3.如权利要求1所述的胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其特征在于步骤1)中所述基本扩增引物组中的正向引物和反向引物的序列选自SEQIDNO1～SEQIDNO180中的引物对。4.如权利要求1所述的胃肠道间质瘤多基因变异文库的构建方法，其特征在于步骤2)中所述PCR富集反应的扩增程序为：预变性1个循环：98℃、2分钟；变性和退火15个循环：变性98℃、15秒...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯英勇，徐晨，蒋冬先，宋琦，王海星，罗荣奎，袁伟，黄洁，徐一凡，阿克苏，曾海英，纪元，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31