编码PCR二代测序建库方法、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种编码PCR二代测序建库方法，步骤包括：1)提取DNA；2)用带随机分子编码序列的单端特异引物进行正向单链线性扩增反应；3)用对侧单端特异引物与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应；4)用测序双端公共接头引物对进行指数扩增反应；5)定量质检，获得DNA文库。本发明专利技术还公开了用上述DNA文库进行测序检测的方法，及包含该DNA文库的编码PCR二代测序建库试剂盒。本发明专利技术通过将样品原始DNA模板序列在初始互补合成中进行编码，使测序结果可以根据编码溯源检出初始DNA模板的真实序列和真实检出分子数，从而显著降低了突变假阳性和假阴性。

Coding PCR two generation sequencing library building method, kit and detection method

The invention discloses a coding PCR second-generation sequencing library construction method, which comprises the following steps: 1) extracting DNA; 2) performing forward single-strand linear amplification with a single-terminal specific primer with a random molecular coding sequence; 3) forming a pair of primers with a pair of contralateral single-terminal specific primers and a common-terminal primer, and 4) performing a single-terminal specific index amplification reaction with a sequencing sequence; Double end common connector primers were used for exponential amplification; 5) quantitative quality control was performed to obtain DNA library. The invention also discloses a method for sequencing and detection with the DNA library, and a second generation sequencing and library building kit for coding PCR containing the DNA library. By coding the original DNA template sequence of the sample in the initial complementary synthesis, the sequencing result can detect the true sequence and the true number of detected molecules of the initial DNA template according to the coding traceability, thereby significantly reducing the false positive and false negative mutations.

【技术实现步骤摘要】
编码PCR二代测序建库方法、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及DNA深度测序检测
，特别是涉及组织、血浆或血清中0.03％～1％低比例的靶序列变异位点不确定的DNA片段的高保真深度测序检测。
技术介绍
基因科学是生命科学的一个重要领域，生命体的基因密码序列及其变异会影响生命体的多种生物功能，导致功能变异，通过检测生命体的基因变异可以了解和预估生命的功能变异，通过定量检测生命体的基因变异情况，也可以精确了解患病生命体的疾病进展和预后，例如肿瘤的进展、复发的有无或早中晚期和治疗效果。当前，检测基因变异已成为分析判断遗传疾病、肿瘤疾病、个体化药物反应特征的重要手段，用于预测和预防出生缺陷，定期监控肿瘤复发，监控肿瘤个体化用药和化疗的治疗效果。目前，基因变异的检测方法主要有一代测序法、二代测序法和三代测序法。一代测序，能可靠地检测变异在20％以上比例的样品，低于20％，检测的可靠性明显降低，所以不能检测低比例(0.05％～1％)基因变异型。当前二代测序法(包括基因建库和上机测序两大环节)的高深度测序(大于5000乘)可以检测基因变异型比例低于10％的样品。因为当前的测序建库方法主要有两种，一种是全基因测序建库，将片段化的DNA样品，进行非特异接头连接而建库，建库连接效率低于30％，造成约70％的原始模板序列信息丢失，对10000个基因组拷贝的DNA样品中5个突变可能因丢失阳性而致假阴性。因此，不可能准确检测到5/10000的突变。因为一般抽血8～10ml，得到血浆4～5ml以下，抽提到的DNA在30～40ng，按3.3pg为一个基因组拷贝，30～40ngDNA约有10000～12000个拷贝。经过建库的丢失，只能剩2000～3000个拷贝，实现有效的10000乘高深度测序很困难。而且，即使5000乘深度的测序，全基因测序的费用也高得惊人，无法普及应用。高深度测序，适合用于靶基因靶区测序，虽然深度很深，但测序靶序列有限，费用不高，可以普及应用，解决肿瘤外周血突变基因检测(又称CT-DNA检测)。靶基因靶区测序，当前的方法有特异捕获法和PCR特异扩增法。特异捕获法应用特异序列探针杂交捕获靶基因靶区片段，首先进行接头连接(效率约30％)，而后进行连接产物纯化，再进行接头扩增，扩增后进行探针杂交捕获，再进行捕获产物扩增。经过连接、捕获，归于原始模板的实际得率约20％。这样10000个原始拷贝，约得到2000个源自初始模板的DNA分子，虽然通过PCR扩增能达到足够的序列，进行5000乘、10000乘测序，但归结于原始模板的序列数没有提高，虽然深度很深，但不能代表10000个原始模板的深度。30多个循环的PCR也会产生不可忽视的错配误差，严重影响测序的保真性和灵敏性。当前方法中，还有采用靶向特异扩增方法获得靶序列，一般特异扩增10～20个循环，然后进行接头再扩增，10～15个循环，总扩增20～35个循环。这同样带来较严重的PCR错配误差问题，增加了检测噪声，降低了检测的信噪比。因为基因扩增的反应中避免不了碱基错配延伸导致突变假阳误差，高保真聚合酶的错配延伸小于普通聚合酶，但仍不可避免。如此扩增，带来的误差性突变达0.5％～2％，这就严重影响了深度测序的保真性，也就影响了深度测序在ct-DNA检测上的应用(ct-DNA测序检测的精度要能达到1/1000突变的净检出能力，才有较高的价值)。中国贝瑞和康公司专利技术了C-smart法对ct-DNA进行深度测序。其方法的特点是，第一步对原始模板进行分子条码接头连接，然后进行20～30个循环的扩增，再对扩增产物环化，再进行环状DNA特异性扩增，实现靶向建库测序。多个循环的扩增带来的错配假阳性误差，能通过分子条码的计算扣除来降低，提高信噪比。其缺点是，连接效率不高(一般不高于30％)，将导致原始模板信息丢失，高度循环的PCR指数扩增，导致低比例的突变比例更低甚至丢失。低比例突变基因多数是来自肿瘤患者外周循环血浆的游离DNA或癌前病变和早期病变的肿瘤组织释放出的DNA的提取物，DNA样品多是片段化的短片段(160～200bp)，为获得更多的含突变位点的扩增产物，一般扩增区域长度设计为70～100bp，突变位点多预设在PCR产物的中间区段。当前检测突变基因低于1％的检测方法主要是数字PCR方法，有的称为微滴数字PCR，也有微孔数字PCR，效果差别较大。这种方法国内外文献报道很多。数字PCR最大的限制是只能进行已知明确突变位点的样品的定量检测，而对常见突变片段，但位点不固定的突变，则无法明确检测。数字PCR方法(包括微滴PCR、微孔PCR)，是低比例变异基因检测的可靠方法。能够检测1/100到1/10000的低比例变异基因。该方法的明显的局限性在于：1)数字PCR，一个反应只能检测1-2个已知确定位点突变基因，不能可靠地对同一样品同时检测多个位点不确定的突变。因为肿瘤变异复杂，多基因多位点突变是肿瘤的重要特征，故检测多基因多位点十分重要，所以当前的数字PCR不能很好满足血浆多位点突变检测的需要。2)数字PCR需要的DNA量较大，一般常规的一次抽血10ML，只够做一个反应，测1～2个位点，要测更多位点则样品量不够。3)仅检测1～2个位点，对肿瘤来说，检测覆盖度太低，应用面太窄。例如，Kras基因是多种肿瘤需要检测的突变基因，最常见的突变是12密码子和13密码子，这里就涉及6个基因碱基位点，一个位点可有3种变异，而且哪个位点突变不固定，且未知。这样，数字PCR就不适合。在肿瘤组织和肿瘤患者外周血检测中，类似的多位点热区突变情况最多，而某单一位点突变比例较低，所以数字PCR的适用性窄，至今未能得到普及应用。4)数字PCR成本太高，检测一个位点，仅材料成本就需要200元到400元。因此，数字PCR至今仅在科学研究领域应用，尚不能用于实际的医学检测。当前市场供应的数字PCR有四家公司，分别是：美国的raindance、美国的伯乐、美国的life、新加坡的clari。前两个是油包水的液滴PCR，后两个是微孔PCR。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种编码PCR的二代测序建库方法，用该方法构建的DNA文库可用于测序检测多个基因靶区的多位点和位点未知的突变片段，且可以溯源计算样品原始DNA分子的检出数和样品原始DNA突变检出数，达到高灵敏度和保真度。为解决上述技术问题，本专利技术的第一种编码PCR二代测序建库方法，步骤包括：1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列、中部带有随机分子编码序列的正向或反向引物进行单链特异线性扩增反应，并对扩增产物进行纯化；3)以步骤2)所得纯化产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列的反向或正向引物，与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述公共接头引物的序列与本步骤所述模板的5’端的公共接头序列相同或互补；4)以步骤3)所得纯化产物为模板，用测序双端公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述测序双端公共接头引物对的序列分别与步骤2)所述正向引物中的公共接头序列和步骤3)所述反向引物中的公共接头序列相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码PCR二代测序建库方法，其特征在于，步骤包括：1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列、中部带有随机分子编码序列的正向或反向引物进行单链特异线性扩增反应，并对扩增产物进行纯化；3)以步骤2)所得纯化产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列的反向或正向引物，与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述公共接头引物的序列与本步骤所述模板的5’端的公共接头序列相同或互补；4)以步骤3)所得纯化产物为模板，用测序双端公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述测序双端公共接头引物对的序列分别与步骤2)所述正向引物中的公共接头序列和步骤3)所述反向引物中的公共接头序列相同或互补；5)定量，质检，获得DNA测序文库。

【技术特征摘要】
1.编码PCR二代测序建库方法，其特征在于，步骤包括：1)提取样本DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列、中部带有随机分子编码序列的正向或反向引物进行单链特异线性扩增反应，并对扩增产物进行纯化；3)以步骤2)所得纯化产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列的反向或正向引物，与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述公共接头引物的序列与本步骤所述模板的5’端的公共接头序列相同或互补；4)以步骤3)所得纯化产物为模板，用测序双端公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述测序双端公共接头引物对的序列分别与步骤2)所述正向引物中的公共接头序列和步骤3)所述反向引物中的公共接头序列相同或互补；5)定量，质检，获得DNA测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述随机分子编码序列包括两段随机序列和一段非随机序列；所述非随机序列位于两段随机序列之间，用于间隔两段随机序列；每段随机序列的碱基数为4bp以上，非随机序列的碱基数为4～6bp；在引物合成时，随机序列各位点上的碱基为合成时随机连接而得，非随机序列各位点上的碱基按照引物设计时所设定的碱基类型固定分配。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述正向或反向单链特异线性扩增反应采用变性、退火、延伸三步法，其中退火阶段采用缓慢降温的退火方式，热循环数为2～10个。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述单端特异指数扩增反应，先采用变性、退火、延伸三步法，其中退火阶段采用缓慢降温的退火方式，热循环数为4～6个；再采用变性、退火延伸两步法，热循环数为15～25个。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述双端非特异指数扩增反应的热循环数为15～20个。6.用于基因突变检测的编码PCR二...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新华，戴慧清，
申请(专利权)人：上海基致生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31