一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法，其主要步骤为：采集不同时期花进行硅胶干燥；将已干燥的花研磨至粉末状，加入提取液，经水浴处理30min~40min，离心；上清液冰浴后离心；上清液加氯仿/异戊醇抽提两次；上清液加无水乙醇，沉淀后弃上清液，加酒精和无水乙醇清洗沉淀物2~3次；风干后加ddH2O溶解即可得到花基因组DNA原液。本发明专利技术获得了一种适于新疆洋葱野生近缘种不同时期花基因组DNA的提取方法，能够获得高质量、完整的基因组DNA。该方法能够根据野生资源不同开花物候阶段进行取样，具有取样准确、量大、时间充足、成本低、操作简便、研磨省力、快速高效的优势。

A method for genomic DNA extraction from wild relatives of Xinjiang onion

The present invention provides a method for extracting genomic DNA from wild allied flowers of Xinjiang onion. The main steps are as follows: collecting flowers at different stages and drying them with silica gel; grinding the dried flowers to powder state, adding the extract solution and treating them with water bath for 30-40 minutes, centrifuging; centrifuging the supernatant after ice bath; adding chloroform/isoamyl alcohol to the supernatant solution. Extraction twice; supernatant with absolute ethanol, precipitation after discarding supernatant, adding ethanol and absolute ethanol to clean the sediment 2 to 3 times; air-dried and ddH2O dissolved to get the flower genome DNA solution. The invention obtains a method for extracting genomic DNA from flowers of wild allies of Xinjiang onion at different stages, and can obtain high quality and complete genomic DNA. This method can be sampled according to different flowering phenological stages of wild resources, and has the advantages of accurate sampling, large quantity, sufficient time, low cost, simple operation, labor-saving grinding, rapid and efficient.

【技术实现步骤摘要】
一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法
本专利技术涉及植物分子生物学领域及基因组DNA制备的
，尤其涉及一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法。
技术介绍
洋葱野生近缘种按照APGIV划分属于石蒜科（Amaryllidaceae）葱属（AlliumL.）多年生草本植物。洋葱野生近缘种为实葶葱（AlliumgalanthumKar.&Kiri.），俗称雪片莲洋葱（snowdroponion）、雪滴莲洋葱，原产地亚洲，国外主要分布于哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、蒙古和俄罗斯；国内仅分布于新疆北部的阿尔泰、布尔津、塔城、博乐及玛纳斯等海拔500~1500m的砾质山坡、峭壁与河谷等地带。新疆洋葱野生近缘种实葶葱是具有食用、药用及观赏价值的植物资源，基于分子生物学的研究认为，实葶葱不仅是洋葱的野生近缘种，而且与大葱（A.fistulosumL.）、阿勒泰葱（A.altaicumPall.）、薤白（A.chinenseG.Don）以及北葱（A.schoenprasumL.）的亲缘关系也较近，实葶葱研究为揭示野生近缘种物种演化和系统关系显得尤为重要。实葶葱不仅是研究亲缘关系、种质创新的亲本材料，而且其经济价值开发利用也具有广泛应用前景。基于分子水平的新疆野生葱属植物亲缘关系研究中，以往主要以鲜嫩叶片为材料提取基因组DNA，然而新疆特殊环境下的葱属植物有些野生种类存在叶片数量少，且容易枯萎，给取样带来困难，有些种类不同程度存在叶片表皮角质层厚现象，导致叶片研磨过程耗时费力，其次，叶片中的硫化物、糖醇、黄酮类以及较高含量的纤维素要求操作过程中多次除杂，影响了DNA纯度和浓度。新疆野生葱属植物基因组DNA的提取还有以成熟种子为材料（专利号20160461767.3），这种方法是针对新疆大蒜野生近缘种种质资源地理分布特征、生活史特征以及叶片生长特点，采用了种子基因组DNA的提取技术，保证野外材料安全获得、准确识别。因此，根据新疆野生葱属植物特点构建适宜的DNA提取技术方法十分必要。洋葱野生近缘种实葶葱的叶片营养成分全面、营养价值高，维生素、类胡萝卜素、可溶性糖、纤维素、蛋白质含量显著高于其它葱蒜类蔬菜，以叶片为材料提取DNA需要多次除杂，提取过程耗时费力。而实葶葱的花一般于6月中旬进入始花期，6月下旬进入盛花期，7月中旬花期结束。花葶近60cm高，伞形花序呈球形，着生于花葶顶端，每1花序有白色小花150~400朵，最多可达620朵，小花十分密集。这些花部特征为花基因组DNA提取提供了充足的材料和取样时间。根据该野生资源不同开花物候阶段，以花为材料进行取样，具有鲜嫩、取样准确、量大、时间充足、成本低、操作简便、研磨省力、快速高效的优势。到目前为止，还没有针对洋葱野生近缘种实葶葱花基因组DNA提取方法的相关报道。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，结合材料年生活史和形态特征，本专利技术提出了一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法。本专利技术的一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法，需通过以下步骤实现：（1）6月中旬~7月中旬野外原生境下标记健康、完整的洋葱野生近缘种成株，以花为材料，依次在开花始期，植株上花序出现50%的花蕾时采集花蕾；在开花盛期，植株上花序的50%小花完全盛开时采集花药散落前的小花；在开花末期，植株上花序小于10%小花仍在盛开时采集花药完全散落后的小花；将采集的花分别迅速放入装有硅胶的采集袋中，室温下干燥。优选地，所述原生境是指洋葱野生近缘种的野外分布的生长地。洋葱野生近缘种是实葶葱。（2）称取0.2g已干燥花器官，加入约30mL液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中。（3）向离心管中加入750μL65℃预热的SDS提取缓冲液，加入2%体积的预冷的β-巯基乙醇，快速涡旋混匀；将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min~40min，每隔5~8min，轻轻混匀。所述SDS提取缓冲液为：SDS2.0g、PVP1g，1MTris10mL、0.5MEDTA4mL、5MNaCl28mL、β-巯基乙醇2mL。优选地，所述的65℃水浴锅中保温30min~40min。作为最佳方案，花蕾、花药散落前的花及花药完全散落后的花水浴时间分别为30min、30min和40min。（4）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心10min。（5）取750μL上清液，加入1/3体积的预冷的5mol/LKAc溶液，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心10min。所述5mol/LKAc溶液为：无水KAc40.5g，pH值为8.0。（6）取600μL上清液，加入700μL预冷的氯仿/异戊醇溶液，再加入1/3体积的NaAc溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心10min。所述氯仿/异戊醇溶液为：氯仿/异戊醇的体积比为24:1。优选地，所述的NaAc溶液为5mol/LNaAc溶液。（7）再次重复步骤（6）。（8）吸取400μL上清液至另一新离心管，加入2倍体积的预冷的无水乙醇和1/2体积的NaAc溶液，上下颠倒混匀，至出现白色絮状物，然后放入-20℃冰箱中保存30min。优选地，所述的所述的预冷的无水乙醇为-20℃预冷的无水乙醇，NaAc溶液为3mol/LNaAc溶液。（9）将步骤（8）所述离心管4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液，得到沉淀物；用4℃预冷的70%酒精清洗沉淀物2次（浸泡约5min）和-20℃预冷的无水乙醇清洗沉淀物1次（浸泡约5min），放入-20℃冰箱中保存5min。（10）将步骤（9）所述离心管从冰箱取出，4℃，12000r/min，离心3min；弃上清液，室温下自然风干10min。（11）风干后加入预冷的35μLddH2O，4℃，12000r/min，离心2min，将沉淀物完全溶解后可得到DNA原液，置于-20℃冰箱中保存备用。本专利技术与现有野生葱属植物基因组DNA其他提取方法对比，具有以下优势：（1）取样方式多，该方法在洋葱野生近缘种不同开花物候阶段均可以取样，取样时间长达一个月左右、取样时间充足、取样量大。（2）野外条件下花比叶片和种子具有更强的种的特异性，更易识别，取样准确。（3）针对洋葱野生近缘种花形态和物质成分含量特征，优选出花蕾和花药散落前的小花水浴时间为30min，花药完全散落后的小花的水浴时间为40min；以加氯仿/异戊醇和5mol/LNaAc溶液及采用-20℃预冷的无水乙醇加3mol/LNaAc溶液，分别作为去除沉淀物中的蛋白质等杂质和沉淀DNA的最佳处理方案，可以从新疆洋葱野生近缘种不同时期的花中获得高纯度、完整的基因组DNA，实现PCR扩增。本专利技术有益效果是：本专利技术获得了一种适合于新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法，提取过程操作简便易掌握，研磨省工省力，快速高效，具有一定的应用前景。附图说明图1是原生境下采集实葶葱不同时期花的图。图2是原生境下采集实葶葱叶片的图。图3是用本方法提取的实葶葱不同时期花基因组DNA的电泳图谱。图4是用本方法提取的实葶葱新鲜叶片基因组DNA的电泳图谱。图5是本方法提取的实葶葱不同时期花基因组DNA进行PCR扩增的电泳图谱。图6是本方法提取的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）6月中旬~7月中旬野外原生境下标记健康、完整的洋葱野生近缘种成株，以花为材料，依次在开花始期，植株上花序出现50%的花蕾时采集花蕾；在开花盛期，植株上花序的50%小花完全盛开时采集花药散落前的小花；在开花末期，植株上花序小于10%的小花仍在盛开时采集花药完全散落后的小花；将采集的花分别迅速放入装有硅胶的采集袋中，室温下干燥；（2）称取0.2g已干燥的花，加入约30mL液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中；（3）向离心管中加入750μL 65℃预热的SDS提取缓冲液，加入2%体积预冷的β‑巯基乙醇，快速涡旋混匀；将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min~40min，每隔5~8min，轻轻混匀；所述SDS提取缓冲液为：SDS 2.0g、PVP 1.0g，1M Tris 10mL、0.5M EDTA 4mL、5M NaCl 28mL、β‑巯基乙醇2mL；（4）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心10min；（5）取750μL上清液，加入1/3体积预冷的5mol/L KAc，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心10min；所述5mol/L KAc溶液为：无水KAc 40.5g，pH值为8.0；（6）取600μL上清液，加入700μL预冷的氯仿/异戊醇，再加入1/3体积的NaAc溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心10min；所述氯仿/异戊醇溶液为：氯仿/异戊醇的体积比为24:1；（7）再次重复步骤（6）；（8）吸取400μL上清液至另一离心管，加入2倍体积的预冷的无水乙醇和1/2体积的的NaAc溶液，上下颠倒混匀，至出现白色絮状物，然后放入‑20℃冰箱中保存30min；（9）将步骤（8）所述离心管4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液，得到沉淀物；用4℃预冷的70%酒精清洗沉淀物2次（浸泡约5min）和‑20℃预冷的无水乙醇清洗沉淀物1次（浸泡约5min），放入‑20℃冰箱中保存5min；（10）将步骤（9）所述离心管从冰箱取出，4℃，12000r/min，离心3min，弃上清液，室温下自然风干10min；（11）风干后加入预冷的35μL ddH2O，4℃，12000r/min，离心2min，将沉淀物完全溶解后可得到DNA原液，置于‑20℃冰箱中保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种新疆洋葱野生近缘种花基因组DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）6月中旬~7月中旬野外原生境下标记健康、完整的洋葱野生近缘种成株，以花为材料，依次在开花始期，植株上花序出现50%的花蕾时采集花蕾；在开花盛期，植株上花序的50%小花完全盛开时采集花药散落前的小花；在开花末期，植株上花序小于10%的小花仍在盛开时采集花药完全散落后的小花；将采集的花分别迅速放入装有硅胶的采集袋中，室温下干燥；（2）称取0.2g已干燥的花，加入约30mL液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中；（3）向离心管中加入750μL65℃预热的SDS提取缓冲液，加入2%体积预冷的β-巯基乙醇，快速涡旋混匀；将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min~40min，每隔5~8min，轻轻混匀；所述SDS提取缓冲液为：SDS2.0g、PVP1.0g，1MTris10mL、0.5MEDTA4mL、5MNaCl28mL、β-巯基乙醇2mL；（4）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心10min；（5）取750μL上清液，加入1/3体积预冷的5mol/LKAc，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心10min；所述5mol/LKAc溶液为：无水KAc40.5g，pH值为8.0；（6）取600μL上清液，加入700μL预冷的氯仿/异戊醇，再加入1/3体积的NaAc溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心10min；所述氯仿/异戊醇溶液为：氯仿/异戊醇的体积比为24:1；（7）再次重复步骤（6）；（8）吸取400μL上清液至另一离心管，加入2倍体积的预冷的无水乙醇和1/2体积的的NaAc溶液，上下颠倒混匀，至出现白色絮状物，然后放入-...

【专利技术属性】
技术研发人员：林辰壹，王丹丹，周晓健，李苗苗，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65