具有改变的多样性支架结构域的结合成员制造技术

本发明专利技术涉及各自包含融合蛋白的结合成员的文库，所述融合蛋白包含插入受体多样性骨架结构域(例如抗体恒定或可变结构域)内的供体多样性骨架结构域(例如富含半胱氨酸的蛋白质)。提供了文库和生成文库的方法、以及筛选方法、结合成员和使用所述结合成员的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的多样性支架结构域的结合成员
本专利技术涉及具有改变的多样性支架结构域的结合成员、这种结合成员的文库产生、以及选择和筛选来自这些文库的结合成员。
技术介绍
抗体人源化涉及将动物CDR与人框架组合。CDR嫁接是用于抗体人源化的公认方法。对动物免疫产生的抗体进行测序，鉴定CDR环，并制备杂交分子，其由具有一个或多个衍生自动物抗体1的CDR的人框架组成。在CDR嫁接中，可能需要引入的肽采用特定的结构来保持原始的结合特异性，并且通常需要通过改变包括框架区内的支持残基的加成残基来“微调”人源化过程。来自其它来源的非抗体肽也已被移植到抗体框架中。Barbas等(1993)将天然存在的整联蛋白结合序列插入人抗体2的VHCDR3区，并且Frederickson等(2006)3克隆了已知结合血小板生成素(TPO)受体进入抗破伤风类毒素抗体的几个CDR区的14聚体肽。将肽的每个末端的2个氨基酸随机化并通过噬菌体展示选择所得到的文库。在US20100041012A1中描述了同样的工作，以及插入已知与促红细胞生成素受体4结合的18个氨基酸的肽。原始的促红细胞生成素受体结合肽序列含有两个半胱氨酸，由于抗体二硫醚键形成的预期问题，其被去除。在这些情况下，2-3个密码子在插入的肽编码区和受体框架之间的连接处被随机化，以从所得噬菌体展示文库中选择最佳连接序列。Liu等将对CXCR4具有结合活性的14-16个氨基酸的肽插入2个不同的CDR(VHCDR3和VHCDR25)中。Kogelberg将采用发夹：α螺旋基序的αVβ617聚体肽插入鼠抗体6的VHCDR3中。该肽含有已知可直接与αVβ6结合的核心RGDLxxL元件。该工作致力于基于文库的方法，重点在于VHCDR3，其试图模仿原始插入物的发夹：α螺旋结构7。在所有这些情况下，该抗体起到引入肽的载体的作用，而不参与靶结合。Gallo等使用另一种多样化方法将肽插入VHCDR3中。抗体多样化天然存在于B细胞内，US8012714描述了在异源哺乳动物细胞内复制这种多样化过程的方法。在成熟的B细胞中，抗体基因通过重组分开的V、D和J区段通过“重组激活基因”(RAG1和RAG2)的活性而组装，导致插入序列的大片段的缺失。在US8012714中，将RAG1和RAG2与包含重组底物的质粒一起引入人胚胎肾细胞(HEK293)中以在非B细胞中复制重组V-D-J连接。这种基于RAG1/2重组的方法利用了哺乳动物细胞的DNA修复和切除机制，并且尚未在原核细胞中得到证实。在WO2013134881A1中使用了相同的基于哺乳动物细胞的体外系统，其中D区段有效地被编码衍生自两个其它结合分子的肽片段的DNA替代。由于RAG1/RAG2驱动的多样化只发生在哺乳动物细胞中，因此该系统不能直接用于原核方法如噬菌体展示。WO2013134881A1例举由Frederickson3和Bowdish(US20100041012A1)使用的相同14聚体肽片段的重链CDR3的引入。将TPO受体结合构建体引入CDR3的中部，因此保留了CDR序列以及在另外的氨基酸中移植以在抗体框架和引入肽之间产生总共12个或更多个氨基酸。WO2013134881A1例举与产生为在抗体框架与9-14个氨基酸范围内的引入肽之间具有组合连接子长度的伸展蛋白-4的抗体融合。Saini等8,9报道了在牛抗体的VH结构域内出现超长的富含半胱氨酸的CDR3。这些构成9％牛抗体应答的40-67个氨基酸的超长VHCDR通常限于与特定Vλ1轻链配对。最近，两种这样的牛抗体的结构已经通过X射线晶体学10测定，揭示了由上升和下降β链形成的异常茎结构，该β链由包含具有由半胱氨酸对形成的多个二硫醚键的肽的“突起”突出。该茎：突起结构由VH结构域的CDR3形成，但茎受到与VHCDR1、VHCDR2以及配偶体Vλ1链的所有CDR的相互作用的支持。因此，这些抗体的整个CDR多样性致力于表现“突起”结构，其自身表现为从支撑框架到“突起”11的第一半胱氨酸为大约38埃的距离。因此，其它CDR与由突起识别的相同表位相互作用的可能性被废除或严重受限。在随后的工作中，“突起”被细胞因子代替，如粒细胞集落刺激因子12和促红细胞生成素13，它们在N和C端连接处通过柔性Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO：1)序列(Gly4Ser)与茎连接。随后显示，刚性β片层茎结构可以用刚性反平行卷曲螺旋结构11代替。将柔性Gly4Ser和Gly-Gly-Ser-Gly(SEQIDNO：2)连接子再次置于卷曲螺旋序列的每一端以“优化所得抗体的折叠和稳定性”。这种结构也使得表现粒细胞集落刺激因子成为可能。Liu等采用了相同方法在两个连接处使用与柔性肽缀合的刚性茎结构以将瘦素和生长激素融合到VHCDR3和VHCDR2和VLCDR314中。在该示例中，保留的抗体结合被认为是潜在的缺点，并且建议使用“无效”抗体配偶体例如抗RSV抗体以避免宿主抗体结合的贡献。Peng等(2015)报道了以保留激动活性的方式将两种天然激动剂(瘦素和促卵泡激素)作为“客体”插入抗体VHCDR3中15。产生了融合文库，其中在每个N端和C端末端的结构域之间插入了5-15个氨基酸的柔性肽以及在每个末端处的随机3个氨基酸(即总连接子长度为16-36个氨基酸)。在HEK293细胞中表达了107个融合变体的文库，并且通过在基于自分泌的筛选方法中的报道基因激活来鉴定保留“客体”的激动剂活性的融合物。抗体的有益半衰期性质延伸到引入客体。Peng等(2015)的方法使用自分泌报道系统在哺乳动物细胞中进行，其中细胞在半固体培养基中生长并且分泌抗体融合物保留在生产细胞附近。因此，在细胞紧邻附近累积的分泌产物浓度相对较高16，这使得难以区分文库中具有改变的表达/稳定性或结合特性的克隆。因此，Peng等(2015)描述的系统内严格性存在限制。此外，功能筛选方法也限于相关受体/报道系统可用的筛选。工作克隆的比例很低(尽管受哺乳动物细胞内源性伴侣蛋白辅助折叠的益处)。抗体代表通常使用的结合支架。作为替代，已经证实了基于非抗体支架的结合成员的产生38,39。这些工程化蛋白质来源于变体文库，其中暴露的表面残基在核心支架38-40上多样化。Betton等(1997)17报道了使用9-10个氨基酸的连接子(DPGG插入物-YPGDP(SEQIDNO：3,4)和PDPGG插入物-YPGGP(SEQIDNO：5,6))将β-内酰胺酶融合到麦芽糖结合蛋白中的几个适应允许位点。Collinet18报道了在N末端插入点使用氨基酸残基SGG或GG并在C末端插入点使用GAG，将β-内酰胺酶或二氢叶酸还原酶插入磷酸甘油酸激酶的允许位点。赋予细菌对氨苄青霉素的抗性的酶β-内酰胺酶的研究也揭示了肽插入可以适应的潜在位点19。Vandevenne等报道了使用在插入的N和C末端各引入6-7个氨基酸的构建体而插入人巨噬细胞壳三糖苷酶20的几丁质结合结构域蛋白的这些位点之一中。Crasson等21通过将纳米抗体插入连接两个螺旋的β-内酰胺酶的允许位点而展示了纳米抗体的功能化。
技术实现思路
本专利技术人已经发现，在第二结合结构域(“受体支架结构域”)内并入结合结构域(“供体多样性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选方法，其包括：(i)提供结合成员的创始文库，所述文库中的每个结合成员包含融合蛋白且任选地包含与所述融合蛋白关联的配偶体结构域，其中所述融合蛋白包含插入受体多样性支架结构域内的供体多样性支架结构域，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且在所述创始文库中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，(ii)针对显示结合活性的结合成员来筛选所述创始文库，以及(iii)对显示所述结合活性的、所述创始文库中的一种或多种结合成员进行鉴定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 GB 1600341.0;2016.12.12 GB 1621070.01.一种筛选方法，其包括：(i)提供结合成员的创始文库，所述文库中的每个结合成员包含融合蛋白且任选地包含与所述融合蛋白关联的配偶体结构域，其中所述融合蛋白包含插入受体多样性支架结构域内的供体多样性支架结构域，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且在所述创始文库中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，(ii)针对显示结合活性的结合成员来筛选所述创始文库，以及(iii)对显示所述结合活性的、所述创始文库中的一种或多种结合成员进行鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的供体相互作用序列和相同的受体相互作用序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的受体相互作用序列和相同的供体相互作用序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的受体和供体相互作用序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的连接子序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有相同的受体和供体相互作用序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种结合成员：(a)回收所述一种或多种结合成员，(b)对所述回收的结合成员针对所述结合活性进行选择，(c)回收所述一个或多个选择的结合成员，(d)任选地重复步骤(b)和(c)一次或多次。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：(iv)在一种或多种鉴定的创始结合成员的氨基酸序列中的一个或多个位置处引入不同的氨基酸残基以产生修饰的结合成员文库，(v)针对显示结合活性的修饰的结合成员来筛选所述修饰的文库，以及(vi)对显示所述结合活性的、所述修饰的文库中的一种或多种修饰的结合成员进行鉴定。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，通过随机诱变或定点诱变引入所述不同的氨基酸。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，所述一个或多个位置在所述一种或多种鉴定的结合成员的所述供体支架、供体相互作用序列、受体支架、受体相互作用序列、连接子或配偶体结构域的氨基酸序列内。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，相对于步骤(iii)中鉴定的所述一种或多种结合成员，一种或多种所述修饰的结合成员的所述结合活性改善。12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种结合成员：(e)回收所述一种或多种修饰的结合成员，(f)对所述回收的修饰的结合成员针对所述结合活性进行选择，(g)回收所述一个或多个选择的结合修饰的成员，以及(h)任选地重复步骤(f)和(g)一次或多次。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括用替代的供体多样性支架结构域置换所述一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员中的所述供体多样性骨架结构域。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域包含相同的支架类别。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域包含相同的供体支架和不同的供体相互作用序列。16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域均为结蛋白。17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述供体多样性支架和所述替代的供体多样性支架包含不同的供体支架和不同的供体相互作用序列。18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中，所述替代的供体多样性支架包含不同的供体相互作用序列。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：(vii)将来自所述一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员的融合蛋白与不同群体的结合配偶体相关联以产生改组的结合成员文库，(viii)针对显示结合活性的改组的结合成员筛选所述改组的文库，(ix)对显示所述结合活性的一种或多种改组的结合成员进行鉴定。20.根据权利要求19所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种改组的结合成员：(i)回收所述一种或多种改组的结合成员，(j)对所述回收的改组的结合成员针对所述结合活性进行选择，(k)回收所述一个或多个选择的结合修饰的成员，以及(l)任选地重复步骤(j)和(k)一次或多次。21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，相对于步骤(iii)和/或步骤(vi)中鉴定的所述一种或多种结合成员，所述改组的结合成员的所述结合活性改善。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将另外的氨基酸序列引入来自所述创始文库、修饰文库和/或改组文库的所述一种或多种鉴定的结合成员的所述融合蛋白或配偶体结构域中。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述另外的氨基酸序列是靶结合序列。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述融合蛋白的供体和受体多样性支架都有助于所述融合蛋白的结合活性。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述结合活性是与靶分子的结合。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述结合成员是所述靶分子的拮抗剂或抑制剂。27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述结合成员是所述靶分子的激动剂、增强剂或激活剂。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和配偶体结构域中的一个与所述靶分子结合，并且所述方法包括修饰或置换所述一种或多种鉴定的结合成员中的所述供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域或配偶体结构域。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过确定所述文库中的所述结合成员与靶分子的结合来筛选所述创始文库、修饰文库或改组文库，其中所述靶分子和所述创始文库、修饰文库或改组文库中的一个被固定。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中，所述创始文库、修饰文库或改组文库通过在报道细胞中表达所述文库并鉴定具有改变的表型的一种或多种报道细胞来筛选。31.根据权利要求29或30所述的方法，其中，与所述靶分子或改变的表型的结合通过流式细胞术、免疫组织化学或ELISA检测。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对所述一种或多种鉴定的结合成员针对稳定性进行选择。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括对所述创始文库、修饰文库和/或改组文库针对其中所述供体多样性支架和/或所述受体多样性支架采用活性构象的结合成员进行选择。34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述受体多样性支架结构域是免疫球蛋白序列，并且所述方法还包括使用免疫球蛋白结合分子筛选所述文库。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合分子是蛋白质L、蛋白质A或抗Ig抗体或抗体片段。36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化所述一种或多种鉴定的结合成员。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述文库中的结合成员展示在包含编码所述结合成员的核酸的核糖体、细胞或病毒的表面上。38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化展示所述一种或多种鉴定的结合成员的所述核糖体、细胞或病毒。39.根据权利要求37或38所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中扩增和/或克隆编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中测序编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中合成或重组表达一种或多种鉴定的结合成员。43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定从所述文库、修饰文库和/或改组文库中鉴定的所述一种或多种结合成员对所述靶分子的活性的影响。44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述靶分子是离子通道，并且确定所述一种或多种鉴定的结合成员对穿过所述通道的离子流的影响。45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其包括从所述创始文库、修饰文库和/或改组文库中合成或重组表达来自一种或多种所述鉴定的结合成员的分离的供体多样性支架结构域。46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其包括将一种或多种所述鉴定的结合成员重新形成为scFv、Fab、scFv-Fc、Fc、IgA、IgD、IgM或IgG。47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将治疗性部分、半衰期延长部分或可检测标记附接于所述一种或多种鉴定的结合成员。48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将来自所述创始文库、修饰文库和/或改组文库或所述分离的供体多样性支架结构域的所述一种或多种鉴定的结合成员与药学上可接受的赋形剂一起配制。49.一种产生结合成员文库的方法，其包括：提供核酸群体，其编码不同种群的包含插入受体多样性支架结构域中的供体多样性支架结构域的融合蛋白，其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，并且所述群体中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，表达所述核酸群体以产生所述不同的群体，以及任选地将所述融合蛋白与配偶体结构域群体相关联，从而产生结合成员文库。50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述核酸在细胞或无细胞核糖体中表达。51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞。52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述真核细胞是植物、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。54.一种结合成员文库，其包含：包含插入受体多样性支架结构域中的供体多样性支架结构域的不同群体的融合蛋白，其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，并且所述群体中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，以及任选地其中所述融合蛋白与结合配偶体相关联以形成异二聚体。55.根据权利要求54所述的文库，其中，所述文库中的结合成员包含：(i)不同的供体相互作用序列和相同的受体相互作用序列，(ii)不同的受体相互作用序列和相同的供体相互作用序列，或(iii)不同的受体和供体相互作用序列。56.根据权利要求55所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有不同的连接子序列。57.根据权利要求56所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有相同的受体和供体相互作用序列和不同的连接子序列。58.根据权利要求54至57中任一项所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有不同的配偶体结构域。59.根据权利要求54至58中任一项所述的文库，其通过根据权利要求49至53中任一项所述的方法产生。60.根据权利要求49至59中任一项所述的方法或文库，其中，所述文库中的各个结合成员展示在包含编码所述结合成员的核酸的核糖体、细胞或病毒的表面上。61...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·克拉特维拉特，J·麦考夫迪，S·苏拉德，T·卢肯斯，E·马斯特斯，M·戴森，
申请(专利权)人：艾恩塔斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB