在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合分子的用途制造技术

本发明专利技术涉及产生编码结合分子(“结合物”)组库的真核细胞文库的方法，其中所述方法使用位点特异性核酸酶来靶向裂解细胞DNA，以通过内源性细胞修复机制增强结合物基因的位点特异性整合。产生真核细胞群，其中编码结合物的基因组库被整合到细胞DNA中的期望基因座(例如，基因组的基因座)以允许表达所编码的结合分子，从而产生表达不同结合物的细胞群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及产生用于筛选和/或选择结合分子如抗体的真核(例如，哺乳动物)细胞文库的方法。文库可用于含有和展示多样性结合物组库(repertoire)以允许筛选结合物，从而选择具有所需性质(诸如对靶分子的特异性)的一种或多种结合物。本专利技术尤其涉及将编码结合物的供体DNA引入真核细胞中以提供其中所需数量的供体DNA分子被精确地整合在细胞中的一个或多个期望基因座处的细胞文库。引言蛋白质工程技术允许产生大型多样性相关分子(例如，抗体、蛋白质，肽)群，从所述相关分子群可分离出具有新颖或改进的结合或催化性质的个别变体。构建其中每一细胞表达个别抗体、肽或者工程化蛋白质的大型真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)群的能力将在鉴定具有所需性质的结合物方面具有很大价值。展示技术的基本原理依赖于结合分子与编码此结合分子的遗传信息的关联。结合分子的结合性质用于分离编码其的基因。此相同的基本原理适用于所有形式的展示技术，包括噬菌体展示、细菌展示、逆转录病毒展示、杆状病毒展示、核糖体展示、酵母展示，以及在高等真核生物如哺乳动物细胞上的展示[1,2,3,4]。展示技术已经通过抗体在丝状噬菌体上的展示(抗体噬菌体展示)最佳地例示，抗体的噬菌体展示在过去的24年中已经提供了重要的工具来用于新颖结合分子的发现和工程化，包括生成人治疗性抗体。使用噬菌体展示时，通过与编码噬菌体外壳蛋白的基因框内(in-frame)克隆编码抗体或者抗体片段的基因，使抗体分子呈现在丝状噬菌体颗粒的表面上。首先将抗体基因克隆到大肠杆菌(E.coli)内，使得每一细菌编码单类抗体。使用标准方法从细菌生成噬菌体导致生成在其表面上展示抗体片段并且将该编码抗体的基因包封在噬菌体中的噬菌体颗粒。细菌或者来源于其的噬菌体的集合被称为“抗体文库”。使用抗体噬菌体展示时，通过使呈现抗体的噬菌体暴露于所关注的靶分子，可使抗体及其相关基因富集在群中。为了允许回收展示识别所关注靶标的结合物的噬菌体，需要将靶分子固定到选择容器的表面上或者需要通过二级试剂从溶液中回收靶分子，例如使用链霉亲和素包覆的珠粒从溶液中回收生物素化的靶蛋白。在将展示结合物的噬菌体文库与靶分子一起温育后，去除未结合的噬菌体。此举涉及洗涤靶标(及相关噬菌体)所附接的基质以去除未结合的噬菌体。可将结合噬菌体及其相关抗体基因回收和/或感染到宿主细菌细胞中。通过使用上文概述的方法，变得有可能富集能够结合所选靶分子的噬菌体克隆的亚群。噬菌体展示文库已经显示为提供丰富的抗体多样性来源，从而提供针对单个靶标的成百上千个独特抗体[5,6,7]。历史上，用于分离新颖抗体结合特异性的展示系统已经基于原核系统并且尤其基于单链Fvs(scFv)以及更少程度地Fab在噬菌体上的展示。结合物在细菌表面上的展示已经被描述但是尚未广泛使用，并且其应用很大程度上限于肽的展示，或者通过免疫法针对结合物预富集的抗体片段的展示[8]。不管包括噬菌体展示的原核展示系统的能力如何，都存在限制。在通过噬菌体或者核糖体展示进行选择之后，通过以下步骤鉴定编码个别结合分子的基因：将所选基因群体引入细菌内；平皿接种细菌群落；挑取菌落；使结合分子表达进入上清液或者胞外质；以及在结合测定法(诸如酶或荧光联免疫吸附测定法(ELISA))中鉴定阳性克隆。虽然鉴定了结合分子，但是此方法未解析关于表达程度以及所得克隆的结合亲和力的信息。因此虽然有可能生成成千上万的结合物，但是筛选产出物的能力受限于需要菌落挑取、液体处理等，再加上关于相对表达水平和亲和力的原始信息有限。结合分子在真核细胞表面上展示有潜力克服这些问题中的一些。结合流式细胞术，真核展示使得能够进行快速、高通量的选择。变得有可能调查在其表面上表达不同结合分子的数百万个细胞克隆。细胞表面展示已经最佳地由格式化为scFv的抗体片段在酵母细胞表面上的展示例示。酵母表面展示的常用模式(modality)利用酵母凝集素蛋白(Aga1p和Aga2p)。如由Chao等人[9]所描述，将编码scFv组库(repertoire)的基因与酵母凝集素Aga2p亚基进行基因融合。然后将Aga2p亚基通过二硫键连接到细胞壁中存在的Aga1p亚基。表达靶标特异性结合分子的酵母细胞可以通过流式细胞术，使用直接或间接标记的靶分子来鉴定。例如，可将生物素化的靶标加入细胞中，并且可用链霉亲和素-藻红蛋白来检测该生物素化的靶标与细胞表面的结合。在群体中，变得有可能使用有限的靶标浓度来辨别表达出具有更高亲和力的结合分子的那些克隆，这是因为这些克隆将捕获更多的靶分子并且将因此表现出更亮的荧光。通常，每个酵母细胞将在细胞表面上展示单一scFv的10,000至100,000个拷贝。为了控制不同细胞中scFv表面表达的变化，Chao等人使用荧光标记的抗标签抗体来测量每个细胞表面上的抗体表达水平，从而允许使表达水平变化归一化。此方法因此允许使展示具有高亲和力的结合分子的酵母细胞与表达高水平的具有较低亲和力的抗体的那些细胞区分开来。因此通过使用荧光活化细胞分选(FACS)，有可能根据所编码的结合分子的亲和力和/或表达水平来分离细胞克隆。还已经证明，真核系统比原核系统更有效地用于展示多链抗体片段，并且尤其是较大的片段，诸如全IgG、FAb、或者scFv与Fc结构域的融合体(scFv-Fc融合体)。如上所述用于酵母细胞的基于珠粒或者基于流式分选的方法还可用于从基于高等真核生物如哺乳动物细胞的展示文库中选择抗体。格式化展示文库并且直接选择作为哺乳动物细胞中的IgG、Fab或者作为scFv-Fc融合体的能力是相对于酵母展示的另一优点。细菌和酵母细胞的糖基化、表达和分泌机制不同于高等真核生物，这产生了具有与在哺乳动物细胞中产生的那些抗体不同的翻译后修饰的抗体。因为用于研究、诊断和治疗应用的抗体的制造通常是在哺乳动物细胞中进行，所以在哺乳动物细胞(或者其它高等真核细胞，如无脊椎动物、鸟类或者植物细胞系)上展示可提供关于下游制造的潜在问题或益处的更好指示，例如鉴定具有最佳表达性质的克隆。此外，在高等真核生物，并且尤其是哺乳动物细胞上展示的情境中发现的抗体可直接应用于基于细胞的报告基因测定，而无需广泛的纯化并且没有来自于细菌和酵母细胞的污染物的复杂化影响。此外，结合物文库可直接在真核报告细胞如哺乳动物细胞中表达以鉴定直接影响细胞表型的克隆。虽然真核展示文库允许实现上述优点，但是仍然存在关于在真核细胞，尤其是高等真核细胞中生成结合物文库的重大问题。引入外源基因(“转基因”)组库以在高等真核生物中表达比在酵母和细菌中表达更困难。高等真核生物的细胞更难处理和放大试验并且转化效率更低。所实现的典型文库大小要小得多。此外，引入的DNA随机地整合在基因组内，从而导致位置效应斑驳(positioneffectvariegation)。此外，通过标准转染或者电穿孔方法引入哺乳动物细胞内的供体DNA作为线性阵列与不同拷贝数的经转染转基因整合。编码抗体基因组库的DNA的引入因此有可能将多种抗体基因引入每一细胞中以致每个细胞表达多种不同抗体。此外，多种抗体基因的存在将减少任何给定抗体的相对表达并且将导致分离出许多过客抗体基因(passengerantibodygene)，从而降低了特定克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生含有编码多样性结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，其包括提供编码所述结合物的供体DNA分子，以及真核细胞，将所述供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，以及培养所述重组细胞以产生克隆，从而提供含有编码所述结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.02 GB 1407852.11.一种产生含有编码多样性结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，其包括提供编码所述结合物的供体DNA分子，以及真核细胞，将所述供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，以及培养所述重组细胞以产生克隆，从而提供含有编码所述结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合物是抗体分子。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体分子是全长免疫球蛋白、IgG、Fab、scFv-Fc或者scFv。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述结合物为多聚体的，包含至少第一亚基和第二亚基。5.一种产生含有编码多样性多聚体结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，每种结合物包含第一亚基和第二亚基，其中所述方法包括提供含有编码所述第一亚基的DNA的真核细胞，以及提供编码所述第二结合物亚基的供体DNA分子；将所述供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，以及培养所述重组细胞以产生含有编码所述多聚体结合物的所述第一亚基和所述第二亚基的DNA的克隆，从而提供含有编码所述多聚体结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。6.一种产生含有编码多样性多聚体结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，每种结合物包含至少第一亚基和第二亚基，其中所述方法包括提供编码所述第一亚基的第一供体DNA分子，以及提供真核细胞，将所述第一供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的第一供体DNA的第一组重组细胞，培养所述第一组重组细胞以产生含有编码所述第一亚基的DNA的第一组克隆，将编码所述第二亚基的第二供体DNA分子引入所述第一组克隆的细胞中，其中所述第二供体DNA整合到所述第一组克隆的细胞DNA中，从而生成含有整合到所述细胞DNA中的第一供体DNA和第二供体DNA的第二组重组细胞，以及培养所述第二组重组细胞以产生第二组克隆，这些克隆含有编码所述多聚体结合物的所述第一亚基和所述第二亚基的DNA，从而提供含有编码所述多聚体结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二供体DNA分子通过包括在所述细胞内提供位点特异性核酸酶的方法而被整合，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物组库是共享共同结构并且具有一个或多个氨基酸序列多样性区域的多个多肽。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物组库是一个或多个互补决定区不同的抗体分子的组库。10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述多聚体结合物是包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域作为单独亚基的抗体分子。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是完整的免疫球蛋白。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是IgG。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是Fab。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述第一亚基包含所述VH结构域并且其中所述第二亚基包含所述VL结构域。15.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述第一亚基包含所述VL结构域并且其中所述第二亚基包含所述VH结构域。16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述抗体分子还包含一个或多个另外的亚基，所述另外的亚基可被引入到所述相同的供体DNA上作为所述第一亚基或者第二亚基，或者其可被整合在所述细胞DNA中的单独位点处。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是高等真核细胞，具有大于2×107个碱基对的基因组大小。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物、鸟类、昆虫或者植物细胞。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物的。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，T淋巴细胞谱系细胞或者B淋巴细胞谱系细胞，或者在《癌细胞系百科全书》或者《癌症中体细胞突变的COSMIC目录》中列出的所述细胞系中的任何一种。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代T细胞或者T细胞系。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代B细胞、B细胞系、前B细胞系或者祖B细胞系。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是鼠前B细胞系1624-5，IL-3依赖性祖B细胞系Ba/F3或者鸡DT40B细胞。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述识别序列在所述细胞的基因组DNA中。25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述识别序列在所述细胞中的附加体DNA中。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶的所述识别序列在所述细胞DNA中仅出现一次或两次。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶裂解细胞DNA以产生充当整合位点的双链断裂。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是大范围核酸酶。29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。30.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是TALE核酸酶。31.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是核酸引导的核酸酶。32.根据权利要求31所述的方法，其中DNA裂解由所述CRISPR/Cas系统定向。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述供体DNA通过同源重组被整合到所述细胞DNA中。34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述供体DNA通过非同源末端接合或者微同源定向的末端接合整合到所述基因组DNA中。35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含用于选择所述供体DNA所整合入的细胞的遗传元件。36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述供体DNA整合到所述细胞DNA中将所述结合物的表达和/或遗传选择元件的表达置于所述细胞DNA中存在的启动子的控制下。37.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含可操作地连接至启动子的编码所述结合物的序列。38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库含有至少100、103、104、105或者106个克隆，每个克隆来源于通过供体DNA的整合而产生的个别重组细胞。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库编码至少100、103、104、105或者106个不同的结合物。40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个克隆含有编码所述结合物组库中的仅一个...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦考夫迪，M·戴森，K·帕特赫本，
申请(专利权)人：艾恩塔斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB