本发明专利技术通过生物大数据探勘的方法进行T细胞表位筛选、MHCII分子三维模型建构、T细胞表位优化设计，合理的设计基于表位的疫苗的肽组合文库，在维持免疫结构抗原表位的同时，模拟跨族群的T细胞表位个体变异特性，以覆盖由于地域或种类差异及高度可变性免疫组织相容复合物的广泛范围，从而得到具有对口蹄疫病毒更有效的T细胞表位，并提供广泛保护力的肽疫苗。实验结果也表明，T细胞表位优化具有相当的可行性，并预期可针对不同物种的不同病毒的各种疫苗进行优化设计。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对T细胞表位进行优化的方法，以及通过该方法制备的肽文库的组合物，尤其涉及牛的基于表位的组合式口蹄疫疫苗。
技术介绍
口蹄疫病毒(FMDV)属于一种急性、高度传染性的病毒，会感染驯养的偶蹄反刍动物，从而对易感动物与动物产品的国际自由贸易产生严重的影响。可以通过直接屠宰染病的动物或是以定期接种疫苗的方式对FMDV加以控制。其中，对于感染、恢复和口蹄疫易感动物进行屠宰是公认最优选的方法。接种疫苗的方式是目前对于大多数口蹄疫流行地区的一种成熟且容易控制疫情的方式，利用这种方法除了具有成本效益外，也可达到医疗防疫的功效。特别是对于亚洲、中东和拉丁美洲等发展中或不发达国家，这些国家口蹄疫的疫情发生频率较高，其政府在确保其动物性食品的安全性与供给源不短缺的条件下，要求对易感染的驯养牲畜事先进行更多的常规FMDV疫苗接种。根据目前疫苗市场规模的统计，仅在中国，口蹄疫疫苗市场预计从2015年至2020年可增加约26.3％的销售金额，同时对于口蹄疫病毒，目前疫苗生产设施方面也必须符合国际兽疫局(OIE)的要求。传统疫苗生产通常在悬浮液或在单层细胞中培养、浓缩、部分纯化病毒，并利用乙烯亚胺灭活病毒并与佐剂混合。由此制得的传统灭活疫苗已被证明能有效预防口蹄疫，但在大规模工业化生产过程中，因为不完全反应或活病毒污染等操作失误，使得传统疫苗的生产过程存在发生污染与扩散的风险。口蹄疫疫苗的接种策略包括使用各流行病毒株分别接种，以防止不同血清型的病毒株再度感染动物。口蹄疫病毒可分为七大类免疫血清型，分别为O、A、C、SAT1(南非1型)、SAT2、SAT3和Asia 1(亚洲1型)，上述七大类免疫血清型还可细分为包括超过65种的亚型，其中有许多抗原性变异已经被确定。此外，在各个血清型中存在一些亚型，针对该血清型的传统疫苗无法提供针对个别亚型的充分保护，由此在目前单一传统疫苗的接种情况之下难以对口蹄疫进行全面控制。因此，现阶段在开发替代性的疫苗设计策略。例如已有合成疫苗的报导，但距离广范利用合成肽疫苗取代传统疫苗，在口蹄疫病情流行的国家根除口蹄疫的希望尚存距离。基于表位的疫苗(epitope-based vaccine，EV)是一种安全、廉价的疫苗生产策略，利用这种方式所生产的疫苗易于运输、储存与接种，兼具许多其它的优点，包括能够诱导广泛的防护作用，快速的疫苗接种方式，以及提供长期的保护性免疫应答。有报道称基于表位的疫苗的设计可成功地针对多种血清型和亚型。基于表位的疫苗所面临的主要挑战在于它们源自病原体广泛变化的基因组，并且在被保护动物的免疫系统中，对于多样性表位抗原的选择，必须通过优化的过程，才能确保在一个族群的动物中都能产生强而有效的免疫应答。根据对基于表位的免疫的认知，已经开发了针对口蹄疫病毒的B和T细胞表位的合成嵌合肽。口蹄疫病毒的早期研究确定了口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1上的主要抗原性位点之一，即暴露在表面的G-H环(氨基酸位置140至160)，其为主要的B细胞表位。而T细胞表位与主要组织兼容性复合体(MHC)分子(在牛中也被称为牛白细胞抗原(BoLA))形成具有足够亲和力的特异性结合，是引发特异于病原体的有效的适应性免疫应答所必需的。然而基于表位的疫苗的良好设计仅通过加入T细胞表位并不足够，所选择的肽应有效覆盖整个物种的族群，并且该T细胞表位必须同时与牛上的各种MHC等位基因产生良好的相互作用。鉴于此，必须进一步阐明BoLA-DR基因的多态性对稳定的肽与MHCII分子结合，以及T细胞受体对MHC结合肽的识别的影响。现有技术中有多种T抗原表位预测工具，但其均存在各自问题。第一种工具是抗原表位数据库。关于抗原表位研究，目前已有超过20万项实验资料发表。其中免疫表位数据库(Immune Epitope Database，IEDB)耗时四年时间搜集九成以上的相关文献，为该领域最具代表性的数据库之一(Vita,Zarebski et al.2010)。IEDB将抗原表位依据实验的实证结果，分类为B细胞抗原表位、T细胞抗原表位或可与MHC结合者，能辨识这些抗原表位的物种包括人类及猪、牛、羊、山羊等多种家畜。使用者可利用抗原表位结构、来源物种、MHC限制性、宿主物种等搜索条件，从该数据库查询各抗原表位的序列、实验方法等详细资料。IEDB资料完全对外开放，因此该数据库对于发展各物种与疾病的肽疫苗非常重要。美中不足的是，IEDB多半仅知晓抗原表位的MHC限制性为MHC I类或MHC II类，但不知晓特定MHC等位基因是什么，缺少研发肽疫苗所需的这项重要信息。此外，IEDB收录的许多文献多是针对特定病原的蛋白质序列逐序合成并测试其抗原性，其中序列重复性极高，对肽疫苗研发者而言，需再通过额外方式剔除这些冗余的信息。第二种工具是抗原表位对多态性MHC分子的结合预测。如前所述，MHC分子的多态性残基多出现于结合抗原表位的口袋处，口袋的化学与容积特性随基因型而异，并对抗原表位的残基产生高度选择性。口袋的结合特异性可利用实验方式加以验证，例如合成各种氨基酸序列所组成的肽并测试其结合能力，藉此获得“口袋分布表”(Sturniolo,Bono et al.1999)。目前口袋分布表资料最为齐全的是ProPred网络工具(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)。人类抗原呈递细胞所表现的MHC II分子大于90％比例由HLA-DR等位基因组成，且HLA-DR等位基因目前已知有100种以上。ProPred提供51种HLA-DR等位基因资料，该工具可用于计算任何氨基酸序列与这些MHC分子结合的可能性(Singh and Raghava 2001)。ProPred的预测方式如下：从目标肽序列取得以九个连续性氨基酸组成的所有可能的肽框架，以这些肽框架作为结合至MHC II上的结合核心，并依据口袋分布表对框架中每个残基给予分数，换算得每个肽框架的总分。单一肽框架的总分大小与该段肽与MHC II的结合能力成正相关(Sturniolo,Bono et al.1999)。尤须注意的是，MHC II结合小沟的P1、P2、P3较不具多态性；且P5和P8位置的抗原表位氨基酸侧链朝向T细胞受体端(TCR)，这两个结合口袋对肽结合能力的影响较小。整体而言，P4、P6、P7、P9的多态性对MHC分子与肽结合的特异性扮演关键角色。ProPred工具基于这项研究基础，其计算肽结合能力的口袋分布表偏重P4、P6、P7、P9，且完全排除P5和P8的影响性(Sturniolo,Bono et al.1999)。透过口袋分布表的演算方式，虽可快速推算肽与特定MHC等位基因的结合能力，然而免疫细胞进行抗原呈递时，T细胞受体端与抗原肽表位的交互作用，仍是无法忽视的重要因素。因此如何一并纳入考虑是未来研发肽疫苗待克服的难题。第三种工具是疏水性力矩计算。T细胞抗原表位以α螺旋二级结构结合至MHC II小沟，且MHC II口袋P1、P4、P6、P7、P9偏好疏水性交互作用，故抗原表位α螺旋与MHC结合面多为疏水性残基，而与T细胞受体结合面则多为亲水性残基。换言之，抗原表位α螺旋的两亲性性质，使其形成朝向MHC结合面的平均疏水性力本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对T细胞表位进行优化的方法，包括以下步骤：1)选择目标物种的适合的T细胞表位；2)对目标物种的MHC‑DR进行同源建模；以及3)对所述T细胞表位进行优化。
【技术特征摘要】
1.一种对T细胞表位进行优化的方法，包括以下步骤：1)选择目标物种的适合的T细胞表位；2)对目标物种的MHC-DR进行同源建模；以及3)对所述T细胞表位进行优化。2.权利要求1的方法，其中步骤1)包括以下步骤：a.选择候选的目标物种的T细胞表位；b.评估T细胞表位结合核心；以及c.计算所述T细胞表位的疏水性力矩。3.权利要求1的方法，其中步骤2)包括以下步骤：a.获取目标物种的MHC-DR的等位基因序列；b.挑选人HLA-DR结构作为与T细胞表位结合核心匹配的模板；c.序列比对和建模；以及d.模型评估。4.权利要求1的方法，其中步骤3)包括以下步骤：a.比较目标物种MHC-DR的MHC-肽复合体的口袋容积，确定MHC口袋分布；b.T细胞表位优化；以及任选地c.对T细胞表位优化进行评估。5.权利要求4的方法，其中步骤b包括以下一或多个步骤：i.在所述T细胞表位结合核心的主要结合位置额外引入尺寸不同的氨基酸残基的复合取代以匹配不同的口袋；ii.在所述T细胞表位结合核心的次要结合位置额外引入附加残基的复合取代以增加结合度；或者iii.延伸肽疫苗上T细胞表位结合核心两端的肽长度以增加结合度。6.权利要求1-5任一项的方法，其中将所述T细胞表位的长度设定为10-20个氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸，例如在所述T细胞表位结合核心序列的N末端和C末端分别还可包括一或多个额外的氨基酸，例如在N末端为额外的4个氨基酸，例如MDRF，或者在N末端为额外的8个氨基酸，例如VDFIMDRF，例如在C末端为额外的2个氨基酸，例如HV。7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述目标物种为人或偶蹄动物，例如牛、猪、羊。8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述目标物...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉凡，王政清，
申请(专利权)人：中牧智合北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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