固体支持物上的扩增子制备和测序制造技术

本公开内容涉及分子生物学领域，并且更加具体地涉及用于在固体表面上捕获、扩增和测序靶多核苷酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景本公开内容一般地涉及用于核酸扩增和测序的方法和组合物，并且更加具体地涉及在固体支持物上捕获和测序靶多核苷酸。由于多核苷酸(例如，DNA或者RNA)中编码的信息对于医学和生命科学具有至高无上的重要性，对快速且廉价地测序多核苷酸存在需求。目前，商业测序技术需要样品和文库制备，此二者均是费力的。此外，读出(readout)慢于许多应用所需。因此，通量有限并且成本相对高。因此，对用于制备靶多核苷酸并对其测序的更加快速且有效的方法存在需求。本公开内容满足该需求并且还提供了相关的优势。实施方案的概述本公开内容提供了一种用于扩增子制备的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物，以及(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性。所述方法可以以10ng或更少的输入核酸使用，并且可以进一步包括对所述第二多个固定的扩增子测序。所述方法还可以用于确定与紊乱或疾病相关的基因的存在，所述基因包括癌症相关基因。无细胞DNA也可以在本公开内容的方法中被采用。本公开内容还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与基因特异性正向引物和反向引物在足以用于杂交的条件下接触，所述基因特异性正向引物中的每种包含独特的序列标志(index)和衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述第二多个固定的扩增子包含85％或更高的均一性；(g)对所述第二多个固定的扩增子测序，以及(h)通过在一个靶多核苷酸种类的一个变异位置处比较三个或更多个核苷酸序列消除一个或更多个靶多核苷酸的随机序列错误，其中所述靶多核苷酸种类通过所述独特的序列标志鉴定，从而确定所述一个或更多个靶多核苷酸中真正的核苷酸序列变异。所述方法可以检测到变异核苷酸位置的0.3％或更低的错配率。附图简述图1是示出了固体支持物上的扩增子的制备和测序的示例性步骤的示意图。图2示出了基因组DNA的多重100个循环测序运行的两种不同输入量的核酸的测序均一性与测序深度的比较。图3示出了从福尔马林固定、石蜡包埋的组织获得的DNA的多重50个循环测序运行的四种不同输入量的核酸的测序均一性与测序深度的比较。图4示出了多重测序运行的从1ml血浆中分离的10ng无细胞DNA的测序均一性和测序深度的比较。图5是示例使用独特的分子条码或核苷酸标志区分真正的核苷酸变异与随机核苷酸测序错误的示意图。图6示出了使用(右)或不使用(左)独特的分子条码校正的核苷酸错配率的比较。图7是示出了通过靶特异性扩增引物将标志一步并入靶多核苷酸中的示意图，其中所述标志在测序引物结合位点的下游。图8是示出了通过测序引物将标志两步并入靶多核苷酸中的示意图，其中所述标志在测序引物结合位点的上游。实施方案的详述本公开内容涉及用于靶多核苷酸的快速且有效的制备和测序的方法。所述方法包括靶多核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增、直接固定到固体支持物、克隆扩增和测序。它们可以被单独使用或者在允许快速的样品至答案(sample-to-answer)的扩增子测序的整合的程序中被一起利用。整合的方法特别有用，因为扩增子文库制备是不必需的，从而消除了与连接相关的无效性。用于测序的整合的方法的其他特别有用的特性包括，例如，消除对于PCR之后的扩增子纯化和额外富集步骤的需求，允许用于扩增子固定的快速杂交步骤，并且可以以非常小量的输入核酸利用，同时获得高质量的测序结果。在一个具体的实施方案中，本公开内容的方法采用靶多核苷酸群体的多重PCR，其中一种引物含有与固定在固定支持物上的寡核苷酸互补的衔接子。扩增的靶多核苷酸群体被固定在固体支持物上而不需要首先经历纯化步骤。固定是通过与已经被预先接种到固体支持物上的靶特异性捕获寡核苷酸杂交进行的。使扩增的靶多核苷酸群体的衔接子末端退火至固定的互补寡核苷酸，并且所述互补寡核苷酸被用作延伸反应中的引物以产生双链靶多核苷酸群体。克隆扩增之后，靶多核苷酸集落(colony)经历由35个循环或更多组成的多重测序。如本文所使用的，术语“多个”是指两个或更多个不同多核苷酸或其他所提及的分子的群体。因此，除非另有明确说明，术语“多个”与群体同义使用。多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个或者更多个不同的群体成员。多个还可以包括200、300、
400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107个或更多个不同的成员。多个包括以上示例性群体数目之间的所有整数。如本文所使用的，术语“靶多核苷酸”意指为分析或作用的目标的多核苷酸。分析或作用包括使多核苷酸经历拷贝、扩增、测序和/或用于核酸询问的其他程序。靶多核苷酸可以包括除了待分析的靶序列之外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可以包括侧接待分析的靶多核苷酸序列的一个或更多个衔接子，包括起引物结合位点作用的衔接子。杂交至捕获寡核苷酸或者捕获引物的靶多核苷酸可以含有延伸超过捕获寡核苷酸的5'或3'末端的核苷酸，以这样的方式使得并非全部靶多核苷酸都能够进行延伸。在特定的实施方案中，如下文进一步详细描述的，多个靶多核苷酸包括不同种类，所述不同种类在它们的靶多核苷酸序列上有差异但是具有对于所述不同种类的两个或更多个相同的衔接子。可以侧接特定的靶多核苷酸序列的两个衔接子可以具有相同的序列，或者所述两个衔接子可以具有不同的序列。因此，多个不同的靶多核苷酸可以在靶多核苷酸序列的每个末端具有相同的衔接子序列或者两个不同的衔接子序列。因此，多个靶多核苷酸中的种类可以包括已知序列区域，所述已知序列区域侧接待通过例如测序评价的未知序列区域。在其中靶多核苷酸在单个末端携带衔接子的情况下，衔接子可以位于靶多核苷酸的3'末端或5'末端。靶多核苷酸可以在没有任何衔接子的情况下使用，在这种情况下引物结合序列可以直接来自靶多核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扩增子制备的方法，所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；以及(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.16 US 61/928,3681.一种用于扩增子制备的方法，所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；以及(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含10ng或更少的输入核酸。3.如权利要求1所述的方法，其中所述足以用于杂交的条件包括孵育10分钟或更少。4.如权利要求1所述的方法，其中所述直接接触步骤(c)包括基本上未纯化的第一多个扩增子。5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一多个扩增子包含高比例的细胞组分。6.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接子与所述多个通用捕获引物互补。7.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括不对称PCR。8.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种引物包括两种引物，并且所述两种引物的至少一种含有所述衔接子。9.如权利要求8所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括多重扩增。10.如权利要求9所述的方法，其中所述多重扩增包括180重或更多重的多重性。11.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。12.如权利要求11所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域。13.如权利要求12所述的方法，其中所述通用捕获引物区域具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。14.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物包含200种或更多种不同的核苷酸序列。15.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含200种或更多种不同的核苷酸序列。16.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含多个基因组核酸。17.如权利要求1所述的方法，其中所述固定的延伸产物的所述扩增包括桥式扩增。18.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包含流动池。19.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括对所述第二多个固定的扩增子测序。20.如权利要求19所述的方法，其中所述测序包括50个循环。21.如权利要求20所述的方法，其中从开始到结束的时间包括3小时
\t或更少。22.一种用于确定癌症相关基因的存在的方法，所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的对一种或更多种不同的癌症特异性的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性；以及(g)对所述第二多个固定的延伸产物测序以确定癌症相关基因的存在或不存在。23.如权利要求22所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含10ng或更少的输入核酸。24.如权利要求22所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包括无细胞DNA(cfDNA)。25.如权利要求22所述的方法，其中所述足以用于杂交的条件包括孵育10分钟或更少。26.如权利要求22所述的方法，其中所述直接接触步骤(c)包括基本上未纯化的第一多个扩增子。27.如权利要求22所述的方法，其中所述衔接子与所述多个通用捕获引物互补。28.如权利要求22所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括不对称PCR。29.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一种引物包含两种引物，并且所述两种引物的至少一种含有所述衔接子。30.如权利要求29所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括多重扩增。31.如权利要求30所述的方法，其中所述多重扩增包括180重或更多重的多重性。32.如权利要求22所述的方法，其中所述固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。33.如权利要求32所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域。34.如权利要求33所述的方法，其中所述通用捕获引物区域具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。35.如权利要求22所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐红霞，亚历克斯·阿拉瓦尼斯，林盛榕，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US