使用下一代系统深度测序HLA 基因扩增子定量分析混合物来非侵入性早期检测实体器官移植物排斥反应技术方案

本发明专利技术是一种检测或评估实体器官移植物(graft)(移植物(transplant))排斥反应的方法，所述方法通过检测移植物(graft)(移植物(transplant))受体的血液样品中的供体特异的HLA等位基因来进行。本发明专利技术还包括检测子代血液样品中母体细胞的存在的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用下一代系统深度测序HLA基因扩増子定量分析混合物 来非侵入性早期检测实体器官移植物排斥反应 专利技术背景 早期检测实体器官移植物排斥反应或移植物损伤是显著未满足的临床需求。基于 活检的方法具有差的灵敏度和高的严重并发症的风险。因此，特别吸引人的是非侵入性检 测，其不需要活检移植的器官。目前，检测血清肌酸酐是移植物排斥反应或损伤的非侵入性 检测。然而，该检测不是非常特异的。此外，可检测的该标志物的上升在移植物排斥反应过 程较晚出现，此时其对于拯救器官常常太晚了。 已经有一些尝试去开发基于核酸的非侵入性方法，用于检测移植物排斥反 应。一些方法依赖于移植物排斥反应信号，如某些排斥反应-相关基因的表达。参见， 例如，Hartono等人，(2011)Non-invasiveDiagnosisofAcuteRejectionofRenal Allografts.CurrOpinOrganTransplant15:35。也已经有尝试去审视受体（recipient) 血液中的供体特异的核酸。这些最初限制于在男性捐献的器官的女性受体中检测的Y-染 色体基因。Morelra等人，（2009)Cell_freeDNAasnon-invasiveacuterejection markerinrenaltransplantation.Clin.Chem. 55:11;Snyder等人，(2011)Universal noninvasivedetectionofsolidorgantransplantrejection.PNAS108:6229。还有 早期尝试以检测受体的血衆中供体特异的HLA序列。Gadi等人，（2006)Solubledonor DNAconcentionsinrecipient'sserumcorrelatewithpancreas-kidneyrejction. Clin.Chem. 52:3。然而，这些尝试广泛地被批评为不成功的：检测的预测价值低，因为在 各组患者中存在信号的巨大变化。（在1^1七61-1^〇￥6，1^，和13118(311，]\1，（2006)1'抑〇1^1^ MicrochimericDNAinPlasmatoDiagnoseandManageOrganTransplantRejection ClinChem52:4中综述）。至今，移植物排斥反应的早期检测，没有可信的非侵入性检测。 专利技术概述 在一个实施方案中，本专利技术是一种通过确定受体的血液样品中供体核酸的分数来 确定实体器官移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法包括：提供来自受体的血液样品； 对样品探测在至少一个基因座处至少一个供体HLA等位基因的存在；并且如果检测到供体 HLA等位基因，则诊断移植物排斥反应或损伤。在该实施方案的变化形式中，所述方法还包 括确定供体HLA等位基因的分数（fraction)，并且如果该分数超过预定的阈值，则诊断移 植物排斥反应或损伤。在该实施方案的进一步变化形式中，所述确定步骤包括计算在样品 中检测的同一基因座处至少一个供体HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的 比率。在该实施方案的更进一步变化形式中，在至少两个基因座处检测所述供体和受体HLA 等位基因，所述至少两个基因座彼此连锁不平衡（linkagedisequilibrium)。在该实施方 案的更进一步变化形式中，在至少两个基因座处检测所述供体和受体HLA等位基因，所述 至少两个基因座彼此不是连锁不平衡。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述至少一 个基因座选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1。在该 实施方案的更进一步变化形式中，所述至少一种供体和受体HLA等位基因包括选自DQA1， 外显子2 ;DQB1，外显子2和3 ;DPA1，外显子2 ;DBP1，外显子2 ;DRB1，外显子2 ;DRB3,外显 子2 ;DRB4,外显子2 ;和DRB5,外显子2的序列或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所 述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实施方案的更进一步变化形式中，对于HLA等 位基因的探测步骤包括测序，尤其是克隆测序。在该实施方案的更进一步变化形式中，探测 包括利用表1中公开的寡核苷酸扩增或检测。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述 方法还包括在测序之前的靶富集步骤。所述靶富集步骤可以包括至少一轮的基因组DNA扩 增或靶捕获。所述克隆测序可以包括以正向引物和反向引物进行的克隆扩增步骤，各个引 物包括接头序列和HLA-杂交序列。在该实施方案的更进一步变化形式中，对于HLA等位基 因的探测包括以下步骤：利用正向引物和反向引物扩增以获得HLA扩增子；进行克隆测序 以确定HLA扩增子的序列；在以上确定的序列中，鉴定在同一基因座处的至少一种受体HLA 等位基因和至少一个供体HLA等位基因；比较以上鉴定的受体和供体HLA序列的数量从而 确定样品中供体核酸的分数。上述方法中的至少一种引物可以选自表1。在该实施方案的 更进一步变化形式中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将HLA基因座处的序列与HLA序列 数据库比较；将所述序列分选到多个与已知HLA等位基因对应的箱（bin)中；鉴定一种或 两种多数序列为受体等位基因；鉴定一种或两种最有代表性的少数序列为供体等位基因。 在该实施方案的更进一步变化形式中，在两个、三个或更多个基因座处检测在同一基因座 处的供体HLA等位基因和受体HLA等位基因。所述三个或更多个基因座可以包含来自基因 DPB1，DQB1和DRB1的序列。在该实施方案的更进一步变化形式中，两个、三个或更多个基因 座处的供体和受体HLA等位基因通过多重PCR在相同反应体积中同时扩增。在该实施方案 的更进一步变化形式中，通过这样的方法定量检测所述HLA等位基因，所述方法包括：将样 品分为多个反应体积，各自包含零至约五个拷贝的靶HLA等位基因；对各个反应体积测定 靶HLA等位基因的存在；比较同一基因座处含有供体HLA等位基因的反应体积的数量和含 有受体HLA等位基因的反应体积的数量，从而确定样品中供体核酸的分数。在该实施方案 的变化形式中，所述测定包括用寡核苷酸PCR扩增，所述寡核苷酸中至少一种选自表1。在 该实施方案的进一步变化形式中，所述方法还包括独立获得在至少一个HLA基因座处的供 体和受体的基因型信息。 在另一个实施方案中，本专利技术是通过确定受体的血液中的供体DNA的浓度是否超 过阈值水平来确定移植物受体是否具有或可能发展出移植物排斥反应的方法，其中供体 DNA的浓度通过这样的方法确定，所述方法包括提供一个体积的来自受体的血液样品；定 量检测在所述体积的样品中的至少一个供体HLA等位基因，确定供体DNA的浓度并将其与 阈值比较，其中如果达到或超过所述阈值，则受体具有或可能发展出移植物排斥反应。在该 实施方案的变化形式中，所述至少一个供体HLA等位基因选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1， DRB3,DRB4,DRB5,DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1等位基因。在该实施方案的进一步变化形式 中，所述至少一个供体HL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过确定受体的血液样品中供体核酸的分数来确定实体器官移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法包括：(a)提供来自所述受体的血液样品；(b)对所述样品探测在至少一个基因座处至少一个供体HLA等位基因的存在；(c)如果检测到所述供体HLA等位基因，则诊断移植物排斥反应或损伤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：亨利·A·埃尔利赫，布赖恩·霍格伦，谢丽·霍尔库姆，普丽西拉·孟萨米，尼古拉斯·牛顿，梅琳达·拉斯特鲁，丹尼尔·R·萨洛蒙，南希·舍恩布伦勒，艾利森·灿，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，斯克里普斯研究所，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH