本发明专利技术提供一种棉花杂交种亲子鉴定方法，该方法使用分布于棉花基因组26条染色体的36对SSR核心引物(Seq ID No.1-72)，通过对两个亲本与待测杂交种进行DNA指纹检测，采用亲权排除位点与双亲杂合位点统计分析后鉴定假设杂交种与亲本的亲子关系。本发明专利技术方法操作简单，准确稳定，适用于棉花杂交种亲子关系快速鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种。
技术介绍
棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民 生活水平的提高具有重要意义。近年来，随着棉花杂交育种工作的迅速开展，加上杂交种所 表现出的杂种优势，棉花杂交种在我国得到了广泛的推广与种植。棉花杂交种具有高产、优 质、抗逆性强等优良特征特性，一般较常规品种增产15%左右。然而，棉花杂交种生产为劳 动密集型产业，制种成本相对较高，杂交种子棉收购价格一般是普通常规棉种的4-5倍，受 利益的驱动，即使在管理严格的情况下，以常规种（或亲本）冒充杂交种、或其他杂交种冒 充畅销杂交种等掺杂使假的现象仍时有发生。依据形态性状进行杂交种田间鉴定的传统手 段时效性差，且容易受到环境与主观因素的影响，杂交种市场混乱的局面难以得到有效控 制。 近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和 蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自 动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简 单重复序列（SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整 个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性，SSR标记已成为品种鉴定首选技 术之一。 由于SSR标记是共显性标记，因此，如果杂交种与亲本间存在亲子关系，则杂交种 的谱带必须由两个亲本提供。如果假设杂交种的某位点表现的谱带在对应的两个假设亲本 上均没有出现，这种不符合孟德尔遗传分离规律的位点即为亲权排除位点，亲权排除位点 数越多，表明亲本与杂交种存在亲子关系的可能性越低。反之，如果假设杂交种的某位点表 现的带型为两个假设亲本上谱带的杂合互补带型，且两个假设亲本在该位点表现为不一样 的带型，这种符合孟德尔遗传分离规律的位点即为双亲杂合位点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组 合， 本专利技术的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本专利技术提供的，所述引物组 合由下列引物对中的两种或两种以上组成：NAU3254-F和NAU3254-R、NAU2277-F和NAU2277-R、NAU1190-F和NAU1190-R、 NAU1071-F和NAU1071-R、MUCS101-F和MUCS101-R、NAU934-F和NAU934-R、NAU1200-F 和NAU1200-R、NAU874-F和NAU874-R、NAU905-F和NAU905-R、NAU1362-F和NAU1362-R、 BNL3257-F和BNL3257-R、BNL1317-F和BNL1317-R、BNL2960-F和BNL2960-R、BNL1231-F和 BNL1231-R、BNL3442-F和BNL3442-R、BNL3261-F和BNL3261-R、BNL1421-F和BNL1421-R、BNL2449-F和BNL2449-R、CIR246-F和CIR246-R、NAU2437-F和NAU2437-R、BNL830-F和 BNL830-R、JESPR292-F和JESPR292-R、NAU1167-F和NAU1167-R、NAU1028-F和NAU1028-R、 CIR216-F和CIR216-R、NAU3110-F和NAU3110-R、BNL3646-F和BNL3646-R、BNL3171-F和 BNL3171-R、NAU1103-F和NAU1103-R、BNL4030-F和BNL4030-R、BNL3140-F和BNL3140-R、 JESPR110-F和JESPR110-R、NAU1125-F和NAU1125-R、BNL827-F和BNL827-R、NAU3588-F和 NAU3588-R、CIR170-F和CIR170-R，其中，F表示上游引物，R表示下游引物；上述引物对的 核苷酸序列分别如SeqIDNo. 1-72所示。 本专利技术还提供含有上述引物组合的鉴定棉花杂交种的试剂盒。优选地，所述试剂 盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试 剂盒还包括标准阳性模板。 本专利技术还提供一种，包括以下步骤： 1)分别提取亲本棉花以及待测棉花杂交种籽粒样品中的DNA; 2)分别以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述引物组合进行PCR扩增反应； 3)分析亲本及杂交种的PCR扩增产物。PCR反应体系以20μ1计为：含1. 5mmol/LMg2+的1XPCR反应缓冲液2μ1，2. 5mM dNTPs0.8y1，20μΜ上、下游引物各 0· 15μ1，2·5υ/μ1TaqDNA聚合酶 0·4μl，20ng/y1 DNA模板 2μ1，ddH20 补齐至 20μ1。PCR反应条件为：95°C2分钟；94°C45秒，55°C45秒，72°C2分钟，共30个循环； 72°C7分钟。 步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分 后，65°C水浴；加入体积比依次为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心取上 清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH20充分溶解DNA， 备用。 优选地，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μ1 SDS提取液，漩涡充分后，65°C水浴30min，间隔lOmin轻摇一次；加入等体积800μ1体积比 依次为25 :24 :1的酸、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，lOOOOrpm离心lOmin;取上 清，加入0. 7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μ1 ΤΕ或ddH20充分溶解DNA，备用。 步骤3)中分析PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（恒功率90W电泳 lh)，然后通过银染检测，对棉花亲本样品与待测杂交种样品的36个位点的DNA指纹谱带进 行比对分析： 亲权排除位点数> 2,判定待测杂交种与亲本无亲子关系； 0 <亲权排除位点数< 1，且双亲杂合位点数> 2,判定待测杂交种与亲本存在亲 子关系； 0 <亲权排除位点数< 1，且双亲杂合位点数< 1，判定待测杂交种为亲本或近似 亲本。 所述银染检测包括以下步骤：用10%乙醇和0.5%冰醋酸组成的固定液固定 5min;用双蒸水快速漂洗1次；用0. 3%AgN03溶液染色5min;用双蒸水快速漂洗1次；用 3%NaOH和0. 5%甲醛组成的显影液显影；用10 %无水乙醇和0. 5%冰醋酸组成的固定液 定影。 本专利技术提供一种棉花杂交种亲子关系DNA指纹鉴定的方法，使用分布于棉花全基 因组26条染色体上的一套核心引物（共36对引物）对两个亲本与待测杂交种进行检测， 所述核心引物的核苷酸序列见表1。 表1棉花杂交种亲子鉴定核心引物核苷酸序列 根据本专利技术的DNA指纹检测方法，其包括提取待测品种的DNA、使用上述36对核心 引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。 本专利技术涉及一种，该方法使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定棉花杂交种的SSR‑PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合由下列引物对中的两种或两种以上组成：NAU3254‑F和NAU3254‑R、NAU2277‑F和NAU2277‑R、NAU1190‑F和NAU1190‑R、NAU1071‑F和NAU1071‑R、MUCS101‑F和MUCS101‑R、NAU934‑F和NAU934‑R、NAU1200‑F和NAU1200‑R、NAU874‑F和NAU874‑R、NAU905‑F和NAU905‑R、NAU1362‑F和NAU1362‑R、BNL3257‑F和BNL3257‑R、BNL1317‑F和BNL1317‑R、BNL2960‑F和BNL2960‑R、BNL1231‑F和BNL1231‑R、BNL3442‑F和BNL3442‑R、BNL3261‑F和BNL3261‑R、BNL1421‑F和BNL1421‑R、BNL2449‑F和BNL2449‑R、CIR246‑F和CIR246‑R、NAU2437‑F和NAU2437‑R、BNL830‑F和BNL830‑R、JESPR292‑F和JESPR292‑R、NAU1167‑F和NAU1167‑R、NAU1028‑F和NAU1028‑R、CIR216‑F和CIR216‑R、NAU3110‑F和NAU3110‑R、BNL3646‑F和BNL3646‑R、BNL3171‑F和BNL3171‑R、NAU1103‑F和NAU1103‑R、BNL4030‑F和BNL4030‑R、BNL3140‑F和BNL3140‑R、JESPR110‑F和JESPR110‑R、NAU1125‑F和NAU1125‑R、BNL827‑F和BNL827‑R、NAU3588‑F和NAU3588‑R、CIR170‑F和CIR170‑R，其中，F表示上游引物，R表示下游引物；上述引物对的核苷酸序列分别如Seq ID No.1‑72所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：匡猛，杨伟华，王延琴，周大云，马磊，方丹，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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