本发明专利技术的目的是提供种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点，为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基。本发明专利技术提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明专利技术所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变位点的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因诊断制品
，具体涉及一种用于检测斑块状角膜营养不良 病的SNP位点。 专利技术背景 斑状角膜营养不良（macularcornealdystrophy,MCD)是一种常染色体隐性遗传 病，以双侧角膜基质进行性雾状混浊及中央角膜变薄为特征，在临床上较为少见，但发病较 严重，早期即明显影响视力。患者通常在10岁以前就双眼较对称发病，视力下降，约在20 岁时病情已比较明显，有畏光、流泪及视力下降的症状，角膜病变初期表现为角膜中央浅基 质层的细小云雾状浑浊，有的为半透明环状。以后这些细小浑浊逐渐融合为多形、不规则的 灰白样，随病情进展向角膜周边延伸和角膜深基质层发展。当角膜混浊的区域向表面扩展 形成凸出角膜表面呈结节状，造成角膜不规则散光，而当混浊区域向弹力层发展时，裂隙灯 下可见角膜后有大量的内皮赘疣。与其他的角膜营养不良不同，斑块状角膜营养不良在病 程发展至晚期，均可出现角膜变薄。 当视力下降明显、影响工作与生活时，可行板层或穿透性角膜移植术进行治疗，但 术后都存在复发的可能。根据ELISA法检查病人血清中硫酸角质素（keratansulfate，KS) 抗原浓度的高低及对角膜组织的免疫组化检查，将斑状角膜营养不良分为三型，I型患者的 血清和角膜中没有KS的免疫反应，IA型患者的血清中没有KS的免疫反应，但角膜中存在 KS的免疫反应，而II患者血清和角膜中都存在KS的免疫反应。 斑块状角膜营养不良发病较早，病情逐渐进展，常双眼发病，对视力影响严重，常 合并角膜上皮糜烂而有刺激症状，除了角膜移植手术，目前尚无更好的治疗方法，而手术供 体匮乏，术后并发症多并且容易复发，加之手术费用昂贵，给患者家庭和社会带来沉重的经 济和精神负担。建立斑块状角膜营养不良的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作 和优生优育，有助于遗传性斑块状角膜营养不良的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突 变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾 病的发生。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点，从而弥补 现有技术的不足。 申请人从一个5代呈常染色体隐性遗传的斑块状角膜营养不良家系中，对该家系 全部成员进行了CHST6基因的测序，找到了该家系的致病基因CHST6存在遗传上的致病突 变，从而促成了本专利技术。 本专利技术提供一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点，为CHST6基因编码 区域由起始密码子起第250-272位碱基。 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下： CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAATSEQIDN0:1 CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC SEQ ID NO :2 CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTC SEQ ID NO :3 CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCT SEQ ID NO:4。 本专利技术提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营 养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本专利技术所提供的基 因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变 位点的快速检测。【附图说明】 图1 :实施例1的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A:参考序 列；B:患者。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基发 生了纯合突变，其碱基CG发生缺失。 图2 :实施例2的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A:参考序 列；B:正常人。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基 发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失。【具体实施方式】 申请人在一个斑块状角膜营养不良家系中发现CHST6基因的突变位点，并证实该 基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本专利技术。 CHST6基因位于染色体16q22,可转录成大约1188bp的mRNA(NCBI登录号为 NM_021615. 4)，直接翻译形成395个氨基酸组成的蛋白质。 下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。 实施例1 :从斑块状角膜营养不良家系中筛选CHST6基因的突变位点 1、提取外周血基因组DNA: 在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外 周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80°C冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后， 取500μL放于离心管，加入等体积ΤΕ(ρΗ8· 0)，混勾，4°C，lOOOOrpm离心10分钟，弃上清。 加入 180μLΤΕ、20μLSDS(10% )、8μL蛋白酶K(10mg/ml)混匀，置于37°C水浴过 夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚（约 300μL)，充分混匀，室温下lOOOOrpm离心10分钟，吸取上清液（约300μL)至一新离心管 中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。 加入等体积的Tris饱和酚：氯仿混合液（酚、氯仿各150μL)，混匀，室温 lOOOOrpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。 加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇各100μL)， 混勾，室温lOOOOrpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。 加入1/10体积3mol/L、pH5. 2醋酸钠（约30μL)，2倍体积预冷100 %乙醇，轻轻 混合，可见白色絮状沉淀。室温lOOOOrpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。向DNA沉淀加入70 %乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温 中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8. 0)，4°C过夜溶解DNA。 对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检 测DNA纯度及浓度。 2、直接测序法寻找该家系内患者CHST6基因的突变 PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系： (l)PCR反应条件：94°C 3min ;94°C 40sec，57°C 40se，72°C 60sec，30-35cycle当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250‑272位的碱基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈鹏，郝晓丹，孙大鹏，赵晓雯，王瑶，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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