一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法，目前已知的STR基因座的分型是公开的，本发明专利技术根据STR基因座的不同分型设计同源臂引物，利用定点突变的方法，获得一个基因座的不同分型，然后将获得的不同基因座分型克隆到质粒中，免去了前期样本筛查的工作，提高了STR标准物制作的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法。
技术介绍
等位基因分型标准物是指某一STR基因座在人群中常见的等位基因混合物，它为每一个等位基因提供DNA片段大小的参照物。等位基因分型标准物对于STR基因座的精确分型十分重要，能够对不同实验室因为仪器和检测条件不同而对同一等位基因检测出不同大小的片段进行校正，是STR基因座分型的标准。重复单位长度为2-6bp的重复序列称为短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)。STR基因座重复序列串联排列，基因扩增片段一般在400bp以下。目前，STR是法医DNA分析中最常用的一类遗传标记。STR在整个人类基因组分布广泛，平均每10kb出现一个。多态STR序列绝大多少位于非编码区，极少数在编码区。目前在人类基因组DNA发现的STR序列达8000多。目前认为链滑动错配是短串联重复序列突变的主要机制。在DNA合成过程中，一条单链DNA可以发生一过性的脱位，生成一个中间性的结构后，再与另一DNA单链错配，形成链滑动错配，继续DNA的复制和修复。滑动错配可以造成缺失、插入或碱基替换。在STR中，一条DNA单链可以向后折叠后再与另一条单链复性，在复性的位置形成环状突出，DNA修复酶可以将环状突出全部或部分切除，造成缺失。另一方面，也可以在无突出链相对突出的位置形成一个缺口，再由聚合酶填补此缺口，DNA重复的数目增加，造成插入突变。STR长度上的差异一般是重复单位的整数。复制滑动、姐妹染色体不等交换和遗传重组都是可导致重复单位数目发生改变的机制，但目前的研究证明复制滑动时导致STR重复数目改变是主要机制。制作STR分型标准物的关键是对不同基因分型的DNA样品的收集，目前报道的方法多是通过收集不同基因型分型的个体基因组DNA，直接以这些样本为模板或克隆到重组质粒中，再以PCR扩增后的产物作为标准物。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法。目前已知的STR基因座的分型是公开的，本专利技术根据STR基因座的不同分型设计同源臂引物，利用定点突变的方法，获得一个基因座的不同分型，然后将获得的不同基因座分型克隆到质粒中，本专利技术免去了前期样本筛查的工作，提高了STR标准物制作的效率。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法，包括如下步骤：S1根据目的STR基因座的序列设计扩增引物，以任一个体人类DNA为模板进行扩增；S2将得到的扩增产物克隆进质粒载体，然后转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S3挑取单克隆进行测序，测序结果通过与原序列进行比对，保存测序正确的重组质粒；S4在目的STR基因座重复区设计同源臂引物作为定点突变引物，并以步骤S3获得的重组质粒为定点突变模板，进行PCR扩增；S5向步骤S4的PCR产物中加入DpnI酶进行孵育，消化掉模板质粒；S6向步骤S5得到的产物中加入重组酶进行孵育；S7将步骤S6的产物转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S8从步骤S7的产物中挑取单克隆进行测序，根据测序结果，选择需要的STR分型，并将相应的重组质粒DNA作为模板进行PCR扩增，得到需要的等位基因分型标准物。需要说明的是，步骤S1中的具体步骤如下：1.1)确定目的STR基因座；1.2)通过NCBI检索所述目的STR基因座的序列信息；1.3)根据序列信息标记所述目的STR基因座重复区序列，并向两端分别延展400bp；1.4)以重复区为中心，以上下游400bp以外序列为引物结合区，进行引物设计；1.5)进行序列人类特异性比对；1.6)进行引物合成。需要说明的是，步骤S4中，在目的STR基因座重复区设计同源臂引物作为定点突变引物的方法为：1)向重复区两端分别延展400bp；2)以重复区为中心，以上下游400bp以外序列为引物结合区，进行引物设计；3)进行序列人类特异性比对；4)进行引物合成。需要说明的是，步骤S5中，孵育的条件为50℃孵育30分钟。需要说明的是，步骤S6中，孵育条件为50℃孵育15分钟。需要说明的是，步骤S8中，在确定需要的STR分型后，选择重复区相应重复次数的重组质粒；对单个含有等位基因插入片段的重组质粒DNA稀释到1ng/ul，以稀释后的重组质粒DNA作为模板进行PCR扩增，将所有重组质粒DNA进行PCR扩增后得到的PCR产物按一定比例混合，得到STR基因座等位基因分型标准物。本专利技术的有益效果在于：目前已知的STR基因座的分型是公开的，本专利技术根据STR基因座的不同分型设计同源臂引物，利用定点突变的方法，获得一个基因座的不同分型，然后将获得的不同基因座分型克隆到质粒中，本专利技术免去了前期样本筛查的工作，提高了STR标准物制作的效率。附图说明图1为本专利技术的实施流程示意图；图2为实施例步骤1)中对STR基因座的序列的扩增结果示意图；图3为实施例步骤8)中测序结果示意图；图4为实施例步骤8)中得到的等位基因分型标准物的示意图。具体实施方式以下将结合附图对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。如图1所示，一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法，包括如下步骤：S1根据目的STR基因座的序列设计扩增引物，以任一个体人类DNA为模板进行扩增；S2将得到的扩增产物克隆进质粒载体，然后转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S3挑取单克隆进行测序，测序结果通过与原序列进行比对，保存测序正确的重组质粒；S4在目的STR基因座重复区设计同源臂引物作为定点突变引物，并以步骤S3获得的重组质粒为定点突变模板，进行PCR扩增；S5向步骤S4的PCR产物中加入DpnI酶进行孵育，消化掉模板质粒；S6向步骤S5得到的产物中加入重组酶进行孵育；S7将步骤S6的产物转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S8从步骤S7的产物中挑取单克隆进行测序，根据测序结果，选择需要的STR分型，并将相应的重组质粒DNA作为模板进行PCR扩增，得到需要的等位基因分型标准物。需要说明的是，步骤S1中的具体步骤如下：1.1)确定目的STR基因座；1.2)通过NCBI检索所述目的STR基因座的序列信息；1.3)根据序列信息标记所述目的STR基因座重复区序列，并向两端分别延展400bp；1.4)以重复区为中心，以上下游400bp以外序列为引物结合区，进行引物设计；1.5)进行序列人类特异性比对；1.6)进行引物合成。需要本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基因分型标准物的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1根据目的STR基因座的序列设计扩增引物，以任一个体人类DNA为模板进行扩增；S2将得到的扩增产物克隆进质粒载体，然后转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S3挑取单克隆进行测序，测序结果通过与原序列进行比对，保存测序正确的重组质粒；S4在目的STR基因座重复区设计同源臂引物作为定点突变引物，并以步骤S3获得的重组质粒为定点突变模板，进行PCR扩增；S5向步骤S4的PCR产物中加入DpnI酶进行孵育，消化掉模板质粒；S6向步骤S5得到的产物中加入重组酶进行孵育；S7将步骤S6的产物转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；S8从步骤S7的产物中挑取单克隆进行测序，根据测序结果，选择需要的STR分型，并将相应的重组质粒DNA作为模板进行PCR扩增，得到需要的等位基因分型标准物。

【技术特征摘要】
1.一种利用定点突变技术制备人类基因短串联重复序列等位基
因分型标准物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1根据目的STR基因座的序列设计扩增引物，以任一个体人类
DNA为模板进行扩增；
S2将得到的扩增产物克隆进质粒载体，然后转化到DH5α感受态
细胞中，铺板培养；
S3挑取单克隆进行测序，测序结果通过与原序列进行比对，保
存测序正确的重组质粒；
S4在目的STR基因座重复区设计同源臂引物作为定点突变引物，
并以步骤S3获得的重组质粒为定点突变模板，进行PCR扩增；
S5向步骤S4的PCR产物中加入DpnI酶进行孵育，消化掉模板
质粒；
S6向步骤S5得到的产物中加入重组酶进行孵育；
S7将步骤S6的产物转化到DH5α感受态细胞中，铺板培养；
S8从步骤S7的产物中挑取单克隆进行测序，根据测序结果，选
择需要的STR分型，并将相应的重组质粒DNA作为模板进行PCR扩增，
得到需要的等位基因分型标准物。
2.根据权利要求1所述的利用定点突变技术制备人类基因短串
联重复序列等位基因分型标准物的方法，其特征在于，步骤S1中的
具体步骤如下：
1.1)确定目的STR基因座；
1.2)通过NCBI检索所述目的STR基因座的序列信息；
1.3)根据序列信息标记所述目的STR基因座重复区序列，并向
两端分别延展400bp；
1.4)以重复区为中心，以上下游400bp以外序...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜伯玮，荣海博，管桦，俞丽娟，聂艳钗，赵颖，金川，张涛，
申请(专利权)人：公安部第一研究所，北京中盾安民分析技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11