【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物
本专利技术涉及候选多肽药物的鉴定,所述候选多肽药物具有所期望的可开发性特征,例如溶解度、在高浓度下配制的能力、非特异性结合倾向低,和最优半衰期。本专利技术进一步涉及通过药物发现(包括抗体发现)来筛选结合剂。
技术介绍
抗体已证实是一类极其成功的药物,迄今为止批准的治疗抗体逾70种,而处于开发流水线中的则更多。然而,在许多方面中,多肽药物(例如抗体)的生产和配制比小分子医药更复杂费劲。许多因素影响开发多肽药物(例如抗体)的可行性,影响着主要候选抗体是否将成功地开发成不仅有效、而且可制造、稳定且安全的药物。此类因素包括化学稳定性(抵抗例如断裂、脱酰胺、氧化和异构化)、物理稳定性(例如构象稳定性、蛋白质展开、聚集和/或沉淀的倾向、胶体稳定性),以及溶液特性(例如溶解度、在溶液中可逆地自缔合的倾向,和高浓度下的粘度)。多肽在细胞培养时以高产量表达的能力也是一个相关考虑因素,因为宿主细胞所分泌的多肽的数量决定了能从培养基中回收的产物的产量。抗体或多肽药物的免疫原性也是一个考虑因素。所有这些因素可以统称为产物的“可开发性”特征。这些因素因为它们影响产品成本和制造可行性、安全特征、给药时程和施药方式而成为重要的考虑因素。在遇到可开发性问题的情况下,它们会影响抗体的效用或商业成功,并且可能导致主要分子在开发过程中失败。抗体药物可开发性和其测量方法的各方面已进行评审1-3。希望生产出在高浓度下稳定、可溶的蛋白质以便施用于患者。举例来说,皮下施药寻求50mg/ml以及更大的抗体浓度,其中必须 ...
【技术保护点】
1.一种结合剂在体外培养的高等真核细胞上的表面呈现水平作为所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标的用途。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171206 GB 1720351.41.一种结合剂在体外培养的高等真核细胞上的表面呈现水平作为所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所培养的细胞是表达结合剂的多样化谱系的展示文库的克隆。
3.一种高等真核细胞的培养文库用于体外选择结合剂以实现在溶液中的较高溶解度和/或较低自缔合倾向的用途,
其中所述文库是各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库,其中已编码的所述结合剂呈现于细胞表面上。
4.一种结合剂发现方法,其中结合剂在展示文库的已培养高等真核细胞克隆表面上的表面呈现水平是用作所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标。
5.一种根据结合剂在溶液中的溶解度和/或自缔合抗性将它们区分或排序和/或富集在溶液中展现较大溶解度和/或较大自缔合抗性的结合剂的方法,其包括
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库,
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆,其中所述结合剂呈现于细胞表面上,
(iii)测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平,任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定,
(iv)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆,以及
(v)鉴定出由所述一种或多种所选克隆编码的在溶液中具有良好溶解度和/或自缔合抗性的结合剂,且任选地提供所选克隆用于一个或多个进一步筛选步骤。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的用途,或根据权利要求4或权利要求5所述的方法,其中所述结合剂是含有跨膜域的多肽。
7.根据权利要求4或权利要求5所述的方法,包括通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平,其中所述试剂结合到所述结合剂的恒定区,任选地其中所述结合剂包括Fc区且所述试剂结合到所述Fc区。
8.根据权利要求4到7中任一项所述的方法,包括根据结合剂在细胞上的表面呈现水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分中,其中将展示表面呈现大于预定阈值的细胞分选到所述收集部分中并且将展示表面呈现低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分中。
9.根据权利要求8所述的方法,其中丢弃部分包括表达临界浓度为至少10mg/ml的比较多肽的细胞,且其中所述收集部分包括表达临界浓度为所述丢弃部分中的所述比较多肽的至少1.5倍高的结合剂的细胞。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法,其中分选是利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行。
11.根据权利要求4到10中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养。
12.根据权利要求4到10中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括在独立容器中培养所述文库中的每种克隆。
13.根据权利要求4到12中任一项所述的方法,其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述亲本结合剂已鉴定为需要改善其在溶液中的溶解度或自缔合抗性。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法,其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆文库,
任选地,其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定出经预测会促进自缔合和/或减小溶解度的一个或多个氨基酸残基,以及使所述一个或更多个氨基酸残基产生突变。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法,其中所述亲本结合剂在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的临界浓度小于50mg/ml且/或在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的溶解度极限小于50mg/ml,
且/或其中所述方法包括鉴定出临界浓度和/或溶解度极限为所述亲本结合剂的至少1.5倍高的由所述一种或多种所选克隆编码的结合剂。
17.根据权利要求4到16中任一项所述的方法,包括基于结合剂在所述细胞克隆上的表面呈现水平来预测所述结合剂的亲水性和/或鉴定出具有较强亲水性的一种或多种所选克隆的结合剂。
18.一种体外筛选展示结合剂的高等真核细胞文库以从所述文库中富集表达结合剂的细胞的方法,所述结合剂在哺乳动物体内结合一种或多种非靶分子的倾向低,所述方法包括
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库,
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆,其中所述结合剂呈现于细胞表面上,
(iii)使所述结合剂暴露于所述一种或多种非靶分子,允许所述结合剂与所述一种或多种非靶分子之间发生结合,
(iv)丢弃对所述一种或多种非靶分子展现较大结合的细胞,
(v)选择对所述一种或多种非靶分子展现较低结合的细胞,以提供所选细胞群,所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆;以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
19.根据权利要求18所述的方法,其包括
(iii)使所述结合剂暴露于包括所述一种或多种非靶分子的基质,允许结合到所述基质,
(iv)丢弃对所述基质展现较大结合的细胞,
(v)选择对所述基质展现较低结合的细胞,以提供所选细胞群,所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆;以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法,其中所述非靶分子包括DNA、肝素、乙酰肝素硫酸盐、软骨素硫酸盐、伴随蛋白、玻糖醛酸,或糖萼的一种或多种组分。
21.根据权利要求18到20中任一项所述的方法,其中对非靶分子的所述结合是低亲和力非特异性结合。
22.根据权利要求18到21中任一项所述的方法,包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养以及使所述混合物暴露于所述基质。
23.根据权利要求18到21中任一项所述的方法,包括将所述文库中的每种克隆在独立容器中培养。
24.根据权利要求18到23中任一项所述的方法,其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述亲本结合剂已鉴定为需要减少对一种或多种非靶分子的结合。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法,其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆文库,
任选地其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定经预测会促进非特异性结合的一个或多个氨基酸残基,以及使所述一个或多个氨基酸残基产生突变。
27.根据权利要求24到26中任一项所述的方法,其中所述亲本结合剂对一种或多种非靶分子展现显著的结合。
28.根据权利要求18到27中任一项所述的方法,其包括
(iii)使所述结合剂暴露于呈现所述一种或多种非靶分子的细胞或珠粒。
29.根据权利要求28所述的方法,其包括检测表达结合剂的细胞与呈现所述一种或多种非靶分子的所述细胞或珠粒的相互作用。
30.根据权利要求29所述的方法,其包括使用AC-SINS检测颗粒间距离以及选择由展现较高颗粒间距离的细胞所呈现的结合剂。
31.根据权利要求18所述的方法,其中所述一种或多种非靶分子被可检测地标记。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述一种或多种非靶分子被荧光标记。
33.根据权利要求32所述的方法,其包括根据对所述一种或多种非靶分子的结合水平、利用FACS将细胞流式分选到收集部分和丢弃部分,其中将显示所述被标记非靶分子的荧光高于预定阈值的细胞分选到所述收集部分并且将显示所述被标记非靶分子的荧光低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分。
34.根据权利要求4到33中任一项所述的方法,其中编码所述结合剂的所述DNA是在强启动子的控制下表达。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述启动子是组成型启动子。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述启动子是所述CMV启动子。
37.根据权利要求34所述的方法,其中所述启动子是已最大限度地诱导表达的诱导型启动子。
38.根据权利要求18到37中任一项所述的方法,其进一步包括随后执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法。
39.根据权利要求18到37中任一项所述的方法,其进一步包括初始执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法。
40.一种选择针对靶标的一种或多种结合剂的方法,其包括
执行根据权利要求5到39中任一项所述的方法,其进一步包括
使所述结合剂暴露于所述靶标,允许同源结合剂识别所述靶标,其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标,以及
选择一种或多种展示同源结合剂的克隆。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其包括
(i)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和所述结合剂结合靶标的水平,以及协同选择展示同源结合剂的克隆,所述同源结合剂展现的表面呈现高于其它克隆;或
(ii)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和非特异性结合到非靶分子的水平,以及协同选择展示结合剂的克隆,与其它克隆相比,所述结合剂展现更高的表面呈现和更低的非特异性结合;或
(iii)同时测定所述结合剂的靶标结合水平和非特异性结合到非靶分子的水平,以及协同选择展示同源结合剂的克隆,所述同源结合剂展现的非特异性结合低于其它克隆。
42.一种鉴定以所期望亲和力识别靶标的结合剂的方法,所述方法包括
(a)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库,其中所述结合剂呈现于所述细胞表面上,且其中被编码的所述结合剂从弱活性启动子表达且/或在细胞表面上以每个细胞100-60,000范围内的拷贝数表达,
(b)使所述文库暴露于所述靶标且允许同源结合剂识别所述靶标,其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标,
(c)分离出结合到所述靶标的细胞以提供所选细胞群,所选细胞群富集展示同源结合剂的细胞,以及任选地
(d)使所选细胞群暴露于针对所述靶标的额外一轮或多轮选择,任选地其中逐渐地减小靶标浓度以提高选择严格度,以及任选地
(e)选出展示同源结合剂的一种或多种克隆,所述同源结合剂对所述靶标具有所期望的亲和力。
43.根据权利要求42所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:J·麦考夫迪,R·佩雷拉,M·R·戴森,K·帕特赫本,J·L·锡尔加宁,
申请(专利权)人:艾恩塔斯有限公司,
类型:发明
国别省市:英国;GB
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