多重核酸合成的组合物和方法技术

本发明专利技术的一些方面涉及设计和产生靶核酸的方法、组合物。具体地，本发明专利技术的方面涉及靶多核苷酸的多重合成。

Compositions and methods for multiplex nucleic acid synthesis

Some aspects of the invention relate to methods and compositions for designing and producing target nucleic acids. Specifically, the aspect of the invention relates to multiple synthesis of target polynucleotides.

【技术实现步骤摘要】
多重核酸合成的组合物和方法相关申请本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请第61/792,245号的权益和优先权，其通过引用全文纳入本文。关于序列表本说明书包括所附序列表，其包括创建于2014年3月13日，名为"127662-014001_ST25.txt"、大小为2.628字节的文件，其内容通过引用全文纳入本文。专利
本专利技术的方法和组合物涉及核酸组装，并且具体地涉及高保真、多重核酸组装反应。背景重组和合成核酸在研究、工业、农业和医学中有许多应用。可以使用重组和合成核酸来表达和获得大量的多肽，包含酶、抗体、生长因子、受体和其它可用于多种医学、工业或农业目的的多肽。也可以使用重组和合成核酸来产生遗传修饰的生物体，包含修饰的细菌、酵母、哺乳动物、植物和其它生物体。遗传修饰的生物体可以用于研究(例如，疾病的动物模型、理解生物过程的工具等)、工业(例如，作为蛋白表达的宿主生物体、用于产生工业产物的生物反应器、环境补救的工具、分离或修饰具有工业应用的天然化合物等)、农业(例如，具有增加的产率或增加的对疾病或环境压力的抗性的经修饰作物)和用于其它应用。重组和合成核酸也可以用作治疗组合物(例如，用于修饰基因表达、用于基因治疗等)或用作诊断工具(例如，病症的探针等)。已经开发了多种技术用于修饰存在的核酸(例如，天然存在的核酸)来产生重组核酸。例如，可以使用核酸扩增、诱变、核酸酶消化、连接、克隆和其它技术的多种组合来产生许多不同的重组核酸。经常使用化学合成的多核苷酸作为用于核酸扩增、诱变和克隆的引物或衔接子。也发展了用于从头核酸组装的技术，其中制备(例如，化学合成)和组装核酸来产生较长的感兴趣的靶核酸。例如，已经开发了不同的多重组装技术用于将寡核苷酸组装成能用于研究、工业、农业和/或医学的较大的合成核酸。因此，需要高保真、低成本的合成多核苷酸的方法。具体地，当前大量申请重点关注在化学合成多核苷酸，包括来自直接基因组序列数据的合成克隆合成法、大基因库合成法和全合成基因组合成法。多核苷酸合成领域的主要目的是快速廉价地合成大量多核苷酸。多核苷酸合成成本的主要部分是进行多核苷酸合成反应的试剂成本。为了降低该成本，反应可以小体积进行，例如在微流体中进行。
技术实现思路
本专利技术的方面涉及产生至少一种靶核酸的方法。在本专利技术的一些方面，所述方法允许在单一反应体积中合成多种不同靶分子。在一个方面，提供生成具有预定序列的至少一种靶核酸的方法。所述方法包括(a)提供具有第一多个突出端的多个双链锚定寡核苷酸；(b)提供具有第二多个突出端的多个双链构建寡核苷酸，其中所述第二多个突出端设计为与所述第一多个突出端互补；(c)杂交并连接所述锚定寡核苷酸和所述构建寡核苷酸；和d)任选重复步骤(a)-(c)，从而产生所述至少一种靶核酸。在一些实施方式中，所述第一多个突出端设计为彼此之间相对相互正交。所述第二多个突出端也可设计为彼此之间相对相互正交。在某些实施方式中，所述锚定寡核苷酸或至少多种锚定寡核苷酸连接至支持物。所述支持物可为固体，例如珠。茎环多核苷酸可替代支持物。所述锚定寡核苷酸可固定于相同支持物或各所述锚定寡核苷酸固定于不同支持物。在一些实施方式中，步骤(a)-(d)在单一反应体积中进行。在另一方面，生成具有预定序列的至少一种靶核酸的方法可包括：(a)连接具有第一多个突出端的第一多个双链寡核苷酸和具有第二多个突出端的第二多个双链寡核苷酸，其中所述第一多个突出端设计为与所述第二多个突出端互补，从而生成第一组多核酸；b)连接具有第三多个突出端的第三多个双链寡核苷酸和具有第四多个突出端的第四多个双链寡核苷酸，其中所述第三多个突出端设计为与所述第四多个突出端互补，从而生成第二组多核酸；和(c)连接所述第一组多核酸和所述第二组多核酸，其中所述第一组多核酸和第二组多核酸设计为具有互补突出端，从而形成至少一种靶核酸。在一些实施方式中，所述第一、二、三、四多个突出端各设计为彼此之间相对相互正交。所述方法还可包括任选重复步骤(a)-(c)。在其他方面，生成具有预定序列的至少一种靶核酸的方法包括：将第一多个双链寡核苷酸和第二多个双链寡核苷酸连接于所述第二多个双链寡核苷酸的5’末端，并将第二多个双链寡核苷酸和第三多个双链寡核苷酸连接于所述第二多个双链寡核苷酸的3’末端，其中所述第一多个双链寡核苷酸具有第一多个3'突出端，所述第二多个双链寡核苷酸具有第一多个5'突出端和第二多个3'突出端，且所述第三多个双链寡核苷酸具有第二多个5'突出端，其中所述第一多个3'突出端设计为与所述第一多个5'突出端互补，并且所述第二多个3'突出端设计为与第二多个5'突出端互补；从而形成至少一种靶核酸。在一些实施方式中，所述第一和第二多个5'和3'突出端各设计为彼此之间相对相互正交。所述方法还可包括任选重复连接步骤。在另一方面，提供生产具有多个突出端的多个双链寡核苷酸的方法。所述方法可包括：(a)熔解第一多个钝末端双链寡核苷酸和第二多个钝末端双链寡核苷酸，形成多个单链寡核苷酸；和(b)使所述多个单链寡核苷酸重新退火，形成具有多个突出端的多个双链寡核苷酸，其中所述多个突出端设计为彼此基本相互正交。在某些实施方式中，所述第一和第二多个钝末端双链寡核苷酸在熔解前进行错误校正或错误减少。在一些方面，所述方法包括提供包含单链5'突出端的至少多个结合支持物的双链寡核苷酸。所述多个寡核苷酸可具有预定序列。在一些实施方式中，所述单链突出端在其3’末端包含与第一多个双链构建寡核苷酸的3’末端序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，所述方法包括提供包含单链5'突出端的至少多个结合支持物的双链寡核苷酸，其中所述多个寡核苷酸具有预定序列，其中所述单链突出端在其3’末端包含与第一多个双链构建寡核苷酸的3’末端序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，所述方法包括生成含单链3’突出端的至少第一多个双链构建寡核苷酸，所述单链3’突出端与多个结合支持物的寡核苷酸互补。在一些实施方式中，所述方法包括使所述至少第一多个构建寡核苷酸杂交至所述多个结合支持物的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法连接所述第一多个构建寡核苷酸，并任选重复步骤b-d，从而生成至少靶核酸。在一些实施方式中，所述连接步骤在连接酶存在下进行。在一些实施方式中，在提供步骤中，所述至少多个结合支持物的双链寡核苷酸包含多个不同单链5’突出端，各5’突出端与多个不同靶核酸互补。所述突出端可为3-20核苷酸长。在一些实施方式中，所述多个结合支持物的双链寡核苷酸固定于单一支持物，例如珠。在一些实施方式中，所述多个靶核酸可在单一支持物上合成。在其他实施方式中，各多个结合支持物的双链寡核苷酸固定于不同支持物，从而可合成多个靶核酸，其中各靶核酸固定于不同支持物，例如珠。在各种实施方式中，合成步骤在单一反应体积中进行。在一些实施方式中，包含单链突出端的多个双链构建寡核苷酸通过扩增结合支持物的模板寡核苷酸来生成，各结合支持物的模板寡核苷酸具有3’侧接序列和5’侧接序列，各侧接序列具有引物结合位点和限制性酶识别位点。所述侧接序列可用IIS型限制性酶切下。在一些实施方式中，包含单链突出端的多个双链构建寡核苷酸通过杂交部分互补的寡核苷酸来生成。在一些实施方式中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成有预定序列的至少一种靶核酸的方法，所述方法包括：a)提供具有第一多个突出端的多个双链锚定寡核苷酸；b)提供具有第二多个突出端的多个双链构建寡核苷酸，其中所述第二多个突出端设计为与所述第一多个突出端互补；c)杂交并连接所述锚定寡核苷酸和所述构建寡核苷酸；和d)任选重复步骤a)‑c)，从而产生所述至少一种靶核酸。

【技术特征摘要】
2013.03.15 US 61/792,2451.一种生成有预定序列的至少一种靶核酸的方法，所述方法包括：a)提供具有第一多个突出端的多个双链锚定寡核苷酸；b)提供具有第二多个突出端的多个双链构建寡核苷酸，其中所述第二多个突出端设计为与所述第一多个突出端互补；c)杂交并连接所述锚定寡核苷酸和所述构建寡核苷酸；和d)任选重复步骤a)-c)，从而产生所述至少一种靶核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多个突出端设计为彼此之间相对相互正交。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第二多个突出端设计为彼此之间相对相互正交。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述锚定寡核苷酸连接至支持物。5.如权利要求4所述的方法，其中所述支持物是固体。6.如权利要求5所述的方法，其中所述支持物是珠。7.如权利要求4所述的方法，其中所述支持物是茎环多核苷酸。8.如权利要求4所述的方法，其中所述锚定寡核苷酸固定于相同支持物。9.如权利要求4所述的方法，其中各所述锚定寡核苷酸固定于不同支持物。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤a)-d)在单一反应体积中进行。11.一种生成至少一种有预定序列的靶核酸的方法，所述方法包括：a)连接具有第一多个突出端的第一多个双链寡核苷酸和具有第二多个突出端的第二多个双链寡核苷酸，其中所述第一多个突出端设计为与所述第二多个突出端互补，从而生成第一组多核酸；b)连接具有第三多个突出端的第三多个双链寡核苷酸和具有第四多个突出端的第四多个双链寡核苷酸，其中所述第三多个突出端设计为与所述第四多个突出端互补，从而...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·雅各布森，D·辛德勒，I·萨奥尔默，S·劳顿，M·J·戈德伯格，M·E·赫德森，L·A·昆，
申请(专利权)人：GEN九股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US