在体外克隆中分选核酸和多重制备物的方法技术

方法和组合物涉及使用高通量测序进行的高保真核酸的分选和克隆。具体地，可从包含具有正确和错误序列的多种核酸的集合中分选具有需要的预定序列的核酸分子。

【技术实现步骤摘要】
在体外克隆中分选核酸和多重制备物的方法相关申请本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请系列号61/851,774、2013年1月16日提交的美国临时申请系列号61/848,961、2012年4月24日提交的美国临时申请系列号61/637,750、2012年4月25日提交的美国临时申请系列号61/638,187和2013年4月24日提交的题为“在体外克隆中分选核酸和多重制备物的方法”，代理人案卷号为127662-013702/US，快递邮件标签号为EV426282790US的美国申请，其各自的全文通过引用纳入本文。
本专利技术的方法和组合物涉及核酸组装，并且具体涉及分选和克隆具有预定序列的核酸的方法。背景重组和合成核酸在研究、工业、农业和医学中有许多应用。可以使用重组和合成核酸来表达和获得大量的多肽，包含酶、抗体、生长因子、受体和其它可用于多种医学、工业或农业目的的多肽。也可以使用重组和合成核酸来产生遗传修饰的生物体，包含修饰的细菌、酵母、哺乳动物、植物和其它生物体。遗传修饰的生物体可以用于研究(例如，疾病的动物模型、理解生物过程的工具等)、工业(例如，作为蛋白质表达的宿主生物体、用于产生工业产物的生物反应器、环境补救的工具、分离或修饰具有工业应用的天然化合物等)、农业(例如，具有增加的产率或增加的对疾病或环境压力的抗性的修饰的作物)和用于其它应用。重组和合成核酸也可以用作治疗组合物(例如，用于修饰基因表达、用于基因治疗等)或用作诊断工具(例如，病症的探针等)。已经开发了多种技术用于修饰存在的核酸(例如，天然存在的核酸)来产生重组核酸。例如，可以使用核酸扩增、诱变、核酸酶消化、连接、克隆和其它技术来产生许多不同的重组核酸。经常使用化学合成的多核苷酸作为用于核酸扩增、诱变和克隆的引物或衔接子。也发展了用于从头核酸组装的技术，其中制备(例如，化学合成)和组装核酸来产生较长的感兴趣的目标核酸。例如，已经开发了不同的多重组装技术用于将寡核苷酸组装成能用于研究、工业、农业和/或医学的较大的合成核酸。然而，现有可用的组装技术的一个限制是相对高的错误率。因此，需要高保真、低成本的组装方法。
技术实现思路
本专利技术的方面涉及分选和克隆具有需要的或预定的序列的核酸分子的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供包含至少两个目标核酸分子群的核酸分子的一个或多个集合(各核酸分子群具有独特的目标核酸序列)，用非目标寡核苷酸标签序列对核酸分子的5’末端和3’末端加标签，其中寡核苷酸标签序列包含独特的核苷酸标签和引物区，稀释带标签的核酸分子，对带标签的核酸分子进行从两端开始的测序反应以得到成对末端读取，并且按照它们相应的独特寡核苷酸标签对的相同性分选具有需要的序列的核酸分子。在另一些实施方式中，该方法包括提供包含至少两个核酸分子群的核酸分子的一个或多个集合，各核酸分子群具有独特的内部核酸序列，以及在其5’末端和3’末端的寡核苷酸标签序列，其中寡核苷酸标签序列包含独特的核苷酸标签和引物区，对带标签的核酸分子进行从两端开始的测序反应以得到成对末端读取，并且按照它们相应的独特寡核苷酸标签对的相同性分选具有需要的序列的核酸分子。在一些实施方式中，各核酸分子群具有不同的需要的核酸序列。在一些实施方式中，独特的核苷酸标签可以连接到核酸分子的5’末端和3’末端。在其他实施方式中，可通过PCR在核酸分子的各末端连接独特的寡核苷酸标签。在一些实施方式中，独特的核苷酸标签可包括完全简并序列、部分简并序列或非简并序列。在一些实施方式中，独特的寡核苷酸标签可包括编码的条形码。例如，独特的核苷酸标签可包括以下的序列：CCWSWDHSHDBVHDNNNNMM或CCSWSWHDSDHVBDHNNNNMM。在一些实施方式中，该方法还包括扩增具有需要序列的核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括使用与引物区和标签核苷酸序列互补的引物扩增具有需要序列的构建体。在一些实施方式中，该方法包括使用与寡核苷酸标签序列互补的引物扩增具有需要序列的构建体。在其他实施方式中，可使用与目标核酸序列互补的引物来扩增具有需要序列的构建体。在一些实施方式中，该方法还包括汇集多种核酸分子以形成核酸分子的集合，其中多种核酸分子各包含具有需要序列的核酸序列群(即，无错核酸序列)和与需要的序列不同的核酸序列群(即，含错核酸序列)。在一些实施方式中，核酸分子可以从头组装。在一些实施方式中，可在汇集步骤之前或在汇集步骤之后稀释多种核酸分子以形成核酸分子的标准化集合。在一些实施方式中，寡核苷酸标签可在稀释来自集合的核酸分子之前连接到核酸分子。在一些实施方式中，该方法还可包括在稀释步骤之后扩增带标签的核酸分子。在其他实施方式中，寡核苷酸标签可在稀释来自集合的核酸分子之后连接到核酸分子。在一些实施方式中，各核酸分子包含5’末端共同衔接子序列和3’末端共同衔接子序列并且寡核苷酸标签序列还包含共同的衔接子序列。在一些实施方式中，设计各核酸分子以具有5’末端共同衔接子序列和3’末端共同衔接子序列。在其他实施方式中，通过连接反应将5’末端共同衔接子序列和3’末端共同衔接子序列添加到各核酸分子。本专利技术的一些方面涉及设计多种寡核苷酸来组装成具有预定序列的感兴趣的核酸序列的方法。在一些实施方式中，该方法包括通过计算机将各感兴趣核酸序列分为部分重叠的构建寡核苷酸序列；选择第一构建寡核苷酸序列组，使得每两个相邻的构建寡核苷酸序列互相重叠N个碱基，其中各N-碱基序列长度为至少4个碱基；互相比较N-碱基序列来满足以下的一种或多种约束条件：N-碱基序列互相差异至少2个碱基，或N-碱基序列在5’末端或3’末端的最后3个碱基中互相差异至少1个碱基；从第一构建寡核苷酸序列组识别满足该约束条件的第二构建寡核苷酸序列组；确定第二寡核苷酸组中寡核苷酸的数量；对满足或超出约束条件的来自第二寡核苷酸组的寡核苷酸并基于寡核苷酸的数量进行分级；并且使用该分级来设计令人满意的部分重叠的构建寡核苷酸的集。在分级步骤中，可选择具有较小数量的寡核苷酸的组，和/或可选择在N-碱基序列中具有较高数量的碱基差异的组。在一些实施方式中，可通过计算机将非目标侧接序列加到所述构建寡核苷酸的至少部分的末端。非目标侧接序列可包含引物结合位点。该方法还包括合成令人满意的部分重叠的构建寡核苷酸的集，例如，在固体支持物上，并且将构建寡核苷酸组装成感兴趣的核酸。在一些方面，本专利技术涉及分离具有预定序列的核酸的方法，该方法包括：提供至少一个核酸分子群；在表面上分离核酸分子的克隆群，确定核酸分子的克隆群的序列，将具有预定序列的克隆群定位，并且扩增具有预定序列的核酸分子。在一些实施方式中，分离步骤可以是通过稀释进行并且表面可以是流动池(flowcell)。在本专利技术的其他方面，分离具有预定序列的核酸的方法包括提供包含无错和含错核酸分子的核酸分子集合，对核酸分子进行加标签，任选地将核酸分子片段化，确定核酸分子的序列，定位无错和含错核酸分子，并且分离无错核酸分子。在一些实施方式中，分离步骤包括以下的一种或多种：融除含错核酸分子，选择性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分选具有预定序列的核酸分子的方法，所述方法包括：/n(a)提供包含至少两个核酸分子群的核酸分子集合，各核酸分子群具有/n(i)对各群而言相同的独特目标核酸序列，所述目标核酸序列具有两个末端；/n(ii)位于各目标核酸分子两端的非目标寡核苷酸标签序列对，由此在所述核酸分子集合中各个寡核苷酸标签序列包含针对各目标核酸序列的独特部分；其中，所述集合是用非目标寡核苷酸标签序列文库给目标核酸分子加标签制得的，所述非目标寡核苷酸标签序列的数量大于所述目标核酸分子的数量；/n(b)对所述目标核酸分子进行从两个末端开始的测序从而得到成对末端读取；并且/n(c)按照它们相应的成对末端读取值来分选具有预定序列的核酸分子。/n

【技术特征摘要】
20120424 US 61/637,750;20120425 US 61/638,187;20131.一种分选具有预定序列的核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)提供包含至少两个核酸分子群的核酸分子集合，各核酸分子群具有
(i)对各群而言相同的独特目标核酸序列，所述目标核酸序列具有两个末端；
(ii)位于各目标核酸分子两端的非目标寡核苷酸标签序列对，由此在所述核酸分子集合中各个寡核苷酸标签序列包含针对各目标核酸序列的独特部分；其中，所述集合是用非目标寡核苷酸标签序列文库给目标核酸分子加标签制得的，所述非目标寡核苷酸标签序列的数量大于所述目标核酸分子的数量；
(b)对所述目标核酸分子进行从两个末端开始的测序从而得到成对末端读取；并且
(c)按照它们相应的成对末端读取值来分选具有预定序列的核酸分子。


2.如权利要求1所述的方法，还包括扩增所述具有预定序列的核酸分子。


3.如权利要求2所述的方法，还包括用引物扩增所述具有预定序列的核酸分子，所述引物与所述寡核苷酸标签序列的至少部分互补。


4.如权利要求1所述的方法，其中，所述目标核酸分子包含第一目标核酸分子群和第二目标核酸分子群，所述第一目标核酸分子群具有所述预定序列，所述第二目标核酸分子群具有不同于所述预定序列的序列。


5.如权利要求4所述的方法，还包括在固相...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·雅各布森，M·J·戈德伯格，LY·A·昆，D·辛德勒，M·E·赫德森，
申请(专利权)人：GEN九股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US