制备性体外克隆的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备性体外克隆的方法。涉及从核酸群(例如核酸序列文库)中分离感兴趣的核酸的方法和装置。

Methods of preparing in vitro cloning

The present invention relates to a method of preparing in vitro cloning. Methods and devices for separating nucleic acids from nucleic acid groups such as nucleic acid sequences, such as nucleic acid sequences.

【技术实现步骤摘要】
制备性体外克隆的方法相关申请本申请要求2011年6月15日提交的美国临时申请序列号61/497,506的权益，其通过引用全文纳入本文。专利
本文提供涉及从核酸序列群选择靶核酸序列的方法。更具体地，提供从核酸序列文库分离出感兴趣的靶序列核酸序列的方法。
技术介绍
克隆核酸并从密切相关但非靶标序列分离出靶序列的方法已经成为常用的分子生物学手段。这些常用方法通常涉及将序列混合物与制得的载体片段整合以制备质粒。随后将所述质粒引入细菌细胞(转化)，其通常使所述菌株具有抗生素抗性。选择菌株细胞并将细胞适当稀释至琼脂平板上，能够鉴定由携带个体序列的个体细菌细胞生长而来的菌落，所携个体序列来自初始混合物。对这些菌落进行后续操作能够从库中的非靶标序列鉴定出靶序。这些常用方法是有缺陷的。其过程缓慢，细胞菌株的转化和随后的菌落生长通常需要过夜。然后，每个菌落必须单独分离并在液体培养基中生长。另一个缺点是转化相对昂贵。有限稀释技术已被用于从汇集的细胞悬液分离单个细胞，以及DNA分子计数。基本方法涉及测定细胞数目或DNA浓度、稀释至非常低的浓度，和等分至分开的孔内以使细胞或DNA分子的数目小于每孔一个。随后的细胞分裂或DNA扩增(如通过PCR)应显示所述孔对于初始空白、接种了一个细胞或分子，和接种了多个细胞或分子的孔的泊松分布。
技术实现思路
本专利技术的方面涉及具有预确定序列的靶核酸分子的分离。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：提供包含多个不同核酸分子的核酸分子群；提供多个寡核苷酸标签；使所述寡核苷酸标签连接多个核酸分子的一个末端从而生成核酸－寡核苷酸标签分子的亚群；使用与多个寡核苷酸标签互补的引物扩增所述多个核酸－寡核苷酸标签分子；以及分离所述核酸－寡核苷酸标签分子亚群中的至少一个靶核酸－寡核苷酸标签分子。在一些实施方式中，所述方法还包括对至少一个分离的靶核酸－寡核苷酸标签分子测序并鉴定所述靶核酸。在一些实施方式中，所述测序步骤通过高通量测序进行。在一些实施方式中，所述方法还包括扩增至少一个靶核酸－寡核苷酸标签分子。在一些实施方式中，所述分离步骤通过有限稀释法进行。在一些实施方式中，扩增所述靶核酸－寡核苷酸标签分子。本专利技术的一些方面涉及分离靶核酸的方法，所述方法包括(a)提供包含多个不同核酸分子的群；(b)提供多个微粒，其中各微粒的表面固定有与所述核酸分子的部分互补的寡核苷酸序列；(c)形成与所述微粒上的互补性寡核苷酸序列杂交的核酸分子群；以及(d)分离至少一个靶核酸分子。在一些实施方式中，各微粒的表面具有单个互补性序列。在一些实施方式中，所述互补性寡核苷酸序列是相同的。而在其它实施方式中，所述互补性寡核苷酸序列是不同的。在一些实施方式中，所述多个核酸分子在一个末端包含寡核苷酸标签。在一些实施方式中，所述多个核酸分子可具有相同的寡核苷酸标签或不同的寡核苷酸标签。在一些实施方式中，所述分离步骤通过有限稀释法进行。在一些实施方式中，所述方法还包括扩增至少一个靶分子。本专利技术的一些方面涉及分离靶核酸的方法，所述方法包括(a)提供包含多个不同核酸分子的群；(b)提供所述核酸分子群的稀释物；(c)将所述核酸分子群分离成样品，所述样品包含单个分子或较小数量的分子；(d)扩增所述单个分子从而形成经扩增的核酸分子；(e)可任选地在不含核酸分子的样品中重复步骤(c)和(d)；以及(f)分离至少一个靶核酸分子。在一些实施方式中，所述靶核酸分子具有预确定的序列。在一些实施方式中，所述方法还包括对至少一个靶核酸分子测序。附图简要说明图1说明通过增加有限稀释进行体外克隆的非限制性示例方法。图2说明使用带有供核酸附着的单配体位点的珠子进行体外克隆的非限制性示例方法。图3说明使用条形码序列(barcodesequence)文库进行体外克隆的非限制性示例方法。具体实施方式本专利技术的方面涉及从包含多个不同核酸序列的库中分析和分离至少一个具有预确定序列的核酸分子的方法与组合物。在本专利技术的一些方面中，核酸序列库包含感兴趣核酸序列的变体和/或长度与感兴趣的核酸序列相似的核酸序列。本专利技术的方面对从核酸序列群(例如核酸序列文库)分离感兴趣的核酸序列而言尤为有用。本文所提供技术的方面对提高核酸合成和装配反应的准确度、产量、通量和/或成本效率而言是有用的。在一些实施方式中，本文公开的方法对分离核酸序列用于装配具有预定序列的核酸分子而言尤为有用。本文中所用的术语“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”可互换使用，并且指天然产生或合成的核苷酸的聚合形式。本专利技术的寡核苷酸和核酸分子可由天然产生的核苷酸形成，例如形成脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子。或者，所述天然产生的寡核苷酸可包含结构修饰以改变其性质，如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。采用天然发生或合成的碱基固相合成寡核苷酸和核酸分子为本领域所熟知。应理解所述术语包括由核苷酸类似物制得的和适用于所述实施方式的RNA或DNA的等同物、类似物，单链或双链多核苷酸。可用于本专利技术的核苷酸包括，例如，天然产生的核苷酸(如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，或核苷酸的天然或合成修饰形式，或人造碱基。本文所用的术语单体指一组小分子中的成员，所述小分子可连接在一起以形成寡聚物、聚合物或由两个或多个成员组成的化合物。聚合物内单体的特定顺序在本文中被称作所述聚合物的“序列”。单体的组包括但不限于，例如，常见L－氨基酸的组、D－氨基酸的组、合成的和/或天然的氨基酸的组、核苷酸的组和戊糖及己糖的组。本文所述的本专利技术的方面主要关于寡核苷酸的制备，但可容易地应用于其它聚合物例如肽或多肽、多糖、磷脂、杂聚物、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯或其它聚合物的制备。如本文所用，术语“预定序列”或“预确定序列”可互换使用，并且表示所述聚合物的序列在合成或组装所述聚合物前是已知且已选定的。具体而言，本文所述的本专利技术的方面主要关于核酸分子的制备，所述寡核苷酸或多核苷酸的序列在合成或组装所述核酸分子前是已知且已选定的。在本文提供的技术的一些实施方式中，使用固定化的寡核苷酸或多核苷酸作为物质来源。在多种实施方式中，本文所述的方法使用寡核苷酸，其序列是基于待合成的最终多核苷酸构建体的序列来确定的。在一个实施方式中，寡核苷酸是短核酸分子。例如，寡核苷酸的长度可以是10至约300个核苷酸、20至约400个核苷酸、30至约500个核苷酸、40至约600个核苷酸或大于约600个核苷酸。但也可使用更短或更长的寡核苷酸。寡核苷酸可被设计为不同长度。在一些实施方式中，可将多核苷酸构建体的序列分为多条较短序列，所述较短序列可使用本文所述的方法平行合成并组装成单个或多个所需的多核苷酸构建体。在一些实施方式中，所述组装过程可包括数个平行和/或连续的反应步骤，其中多个不同核酸或寡核苷酸得以合成或固定化、引物延伸并结合以组装(例如，如本文所述通过延伸或连接)形成较长的核酸产物，以用于进一步组装、克隆或其它应用。在一些实施方式中，根据本文公开方法制备的核酸分子可用于核酸组装和包含具有预定序列变化的核酸文库的组装。本文提供的组装策略可用于生成代表感兴趣的多种不同核酸序列的很大的文库。在一些实施方式中，核酸文库是序列变体的文库。序列变体可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离靶核酸的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个不同核酸分子的核酸分子群；(b)提供多个寡核苷酸标签；(c)使所述寡核苷酸标签连接至所述多个核酸分子的一个末端，从而产生核酸－寡核苷酸标签分子亚群；(d)采用与所述多个寡核苷酸标签互补的引物扩增所述多个核酸－寡核苷酸标签分子；和(e)分离所述核酸－寡核苷酸标签分子亚群的至少一个靶核酸－寡核苷酸标签分子。

【技术特征摘要】
2011.06.15 US 61/497,5061.一种分离靶核酸的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个不同核酸分子的核酸分子群；(b)提供多个寡核苷酸标签；(c)使所述寡核苷酸标签连接至所述多个核酸分子的一个末端，从而产生核酸－寡核苷酸标签分子亚群；(d)采用与所述多个寡核苷酸标签互补的引物扩增所述多个核酸－寡核苷酸标签分子；和(e)分离所述核酸－寡核苷酸标签分子亚群的至少一个靶核酸－寡核苷酸标签分子。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还对至少一个分离的靶核酸－寡核苷酸标签分子测序。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还鉴定所述靶核酸。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测序步骤通过高通量测序进行。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还扩增至少一个靶核酸－寡核苷酸标签分子。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离步骤通过有限稀释进行。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还扩增所述靶核酸－寡核苷酸标签分子。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸具有预确定的序列。9.一种分离靶核酸的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个不同核酸分子的群；(b)提供多个微粒，其中各微粒均具有固定在其表面上与所述核酸分子的部分互补的寡核苷酸序列；(c)形成与所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：LY·A·昆，D·辛德勒，J·杰可布森，
申请(专利权)人：GEN九股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US