核酸文库及其制造方法技术

本发明专利技术提供了用于设计和产生非随机核酸文库的方法。具体地，采用通过多重多聚核苷酸合成进行的非随机文库合成。各文库成员可编码启动子、核糖体结合位点和多肽。

Nucleic acid libraries and their manufacturing methods

【技术实现步骤摘要】
核酸文库及其制造方法相关申请本申请要求2013年11月27日提交的美国临时申请号61/909,537的权益和优先权，其全部内容通过引用纳入本文。关于序列表本说明书包括所附序列表，其包括创建于2014年11月25日，名为"127662-014601PCT_ST25.txt"、大小为6,327字节的文件，其内容通过引用全文纳入本文。专利
本专利技术的方法和组合物涉及核酸文库，具体涉及包含非随机变体的核酸文库的设计和组装。背景重组和合成核酸在研究、工业、农业和医学中有许多应用。可以使用重组和合成核酸来表达和获得大量的多肽，包含酶、抗体、生长因子、受体和其它可用于多种医学、工业或农业目的的多肽。也可以使用重组和合成核酸来产生遗传修饰的生物体，包含修饰的细菌、酵母、哺乳动物、植物和其它生物体。遗传修饰的生物体可以用于研究(例如，疾病的动物模型、理解生物过程的工具等)、工业(例如，作为蛋白表达的宿主生物体、用于产生工业产物的生物反应器、环境补救的工具、分离或修饰具有工业应用的天然化合物等)、农业(例如，具有增加的产率或增加的对疾病或环境压力的抗性的经修饰作物等)和用于其它应用。重组和合成核酸也可以用作治疗组合物(例如，用于修饰基因表达、用于基因治疗等)或用作诊断工具(例如，病症的探针等)。已经开发了多种技术用于修饰存在的核酸(例如，天然存在的核酸)来产生重组核酸和核酸变体。具体而言，已采用变体文库来选择或筛选具有所需性质的核酸或蛋白质产物。因此，极其需要核酸的从头合成法，用于更广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的方面涉及生成非随机核酸文库的方法，所述非随机核酸文库包含多种感兴趣的预选定或预定序列。本专利技术的其它方面涉及非随机核酸文库，其包含多种感兴趣的预选定或预定序列。本专利技术的方面涉及生成非随机核酸文库的方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供第一体积的第一组部分双链核酸(partialdouble-strandednucleicacid)，其中第一组双链核酸中的各核酸具有相同的单链突出端，其中第一组部分双链核酸中的各核酸具有不同于第一组部分双链核酸中的另一核酸的预定序列的预定序列；(b)提供第二体积的第二组部分双链核酸，其中第二组部分双链核酸中的各核酸具有与第一组部分双链核酸中的突出端互补的相同的单链突出端，和(c)通过将第一组部分双链核酸与第二组部分双链核酸混合来组装所述核酸文库，所述混合在使互补的突出端杂交的条件下进行，以形成非随机变体靶核酸的文库。在一些实施方式中，第二组部分双链核酸具有预定序列，所述预定序列可以不同于第二组部分双链核酸中的另一序列。而在其它实施方式中，第二组部分双链核酸具有预定序列，所述预定序列可与第二组部分双链核酸中的另一序列相同。在一些实施方式中，第一和第二组部分双链核酸具有3'突出端。而在其它实施方式中，第一和第二组部分双链核酸具有5'突出端。在一些实施方式中，组装步骤可以在单一反应体积中进行。在一些实施方式中，在组装步骤中，互补的突出端杂交以形成无缺口的接合(gaplessjunction)。在一些实施方式中，连接所述无缺口的接合。在一些实施方式中，所述方法包括：提供第一体积的第一组钝端双链核酸集，其中第一钝端双链核酸集里的第一核酸具有从第一钝端双链核酸集里的第二核酸偏移n个碱基的序列，并且，其中各钝端双链核酸集中的各双链核酸是该集中另一双链核酸的变体。在一些实施方式中，所述方法还包括提供第二体积的第二组钝端双链核酸集，其中第二钝端双链核酸集里的第一核酸具有从第二钝端双链核酸集里的第二核酸偏移n个碱基的序列。在一些实施方式中，n可以是2、3、4、5、6、7，或8个碱基。在一些实施方式中，n可以是大于8个碱基。例如，n可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多碱基。第一组钝端双链核酸集可以在第一体积中解链或去杂交，以形成第一体积的单链核酸。类似地，第二体积的第二组钝端双链核酸集可以经变性或去杂交以形成第二体积的单链核酸。多个单链寡核苷酸可退火以形成第一体积的具有单链突出端的第一组部分双链寡核苷酸和第二体积的具有单链突出端的第二组部分双链寡核苷酸。在一些实施方式中，第二组钝端双链核酸集中的各双链核酸是该集中的另一双链核酸的变体。在一些实施方式中，所述方法还包括第三体积的第三组部分双链核酸，其中第三组双链核酸中的各核酸具有相同的单链突出端，其中第三组部分双链核酸中的各核酸具有预定序列，该预定序列不同于第三组部分双链核酸中的另一核酸的预定序列。在一些实施方式中，所述方法还包括组装变体核酸的文库，该组装通过在足以与互补的突出端杂交的条件下混合第一、第二和第三组部分双链核酸来进行，由此形成非随机变体靶核酸的文库。在一些实施方式中，所生成的文库可以是基因文库。在一些实施方式中，各双链核酸的大小可以是约20个碱基对-约200个碱基对。在一些实施方式中，所生成的文库可以是基因文库。在一些实施方式中，各双链核酸的大小可以是约200个碱基对-约500个碱基对。而在其它实施方式中，所生成的文库可以是代谢通路文库。在一些实施方式中，各双链核酸的大小可以是约500个碱基对-约3,000个碱基对。在一些实施方式中，各双链核酸可以是基因或基因的集。在一些实施方式中，各双链核酸可包含遗传元件。在一些实施方式中，各双链核酸可以是操纵子，其包括启动子序列、核糖体结合位点序列、基因或基因的集、终止子或其任何组合。在一些实施方式中，所述文库可以是操纵子文库，其包含具有不同强度的启动子。在一些实施方式中，所述文库可以是操纵子文库，其包含具有不同强度的核糖体结合位点。根据本专利技术的一些方面，生成核酸文库的方法包括如下步骤：鉴定靶核酸、在靶核酸中鉴定第一区域，其中第一区域包含变体核酸序列；和在靶核酸中鉴定第二区域，其中第二区域包含非变体序列。在一些实施方式中，靶核酸可包含一个或多个非变体区或恒定区、一个或多个可变区及其组合。然后，可在包含变体核酸序列的至少第一组寡核苷酸和包含非变体核酸序列的至少第二组寡核苷酸中解析靶核酸。可提供并组装至少第一和第二组寡核苷酸。在一些实施方式中，该文库可以采用基于聚合酶的组装反应、基于连接酶的组装反应，或其组合来组装。在一些实施方式中，靶核酸可编码具有一个或多个结构域的多肽。在一些实施方式中，变体核酸序列可包含编码一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的缺失、编码一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的插入，或其组合。在一些实施方式中，所述变体核酸序列可具有如下任何情况：一个或多个核酸序列的缺失、一个或多个核酸序列的插入、一个或多个取代，或前述任何情况的两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，所述缺失可以是编码一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的缺失。在一些实施方式中，所述插入可以是编码一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的插入。在一些实施方式中，所述取代可以是编码一个或多个结构域的至少部分的核酸序列中的核苷酸的取代。在一些实施方式中，所述缺失、插入或取代(或前述任何组合)可以是一个或多个倍数的3核苷酸。在一些实施方式中，所述缺失、插入或取代(或前述任何组合)可包含单一倍数的3个连续核苷酸。在其它实施方式中，所述缺失、插入或取代(或前述任何组合)可包含五组或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生核酸文库的方法，所述方法包括：(a)鉴定靶核酸；(b)在所述靶核酸中鉴定第一区域，其中所述第一区域包含变体核酸序列；(c)在所述靶核酸中鉴定第二区域，其中所述第二区域包含非变体序列；(d)在包含所述变体核酸序列的至少第一组寡核苷酸和包含所述非变体核酸序列的至少第二组寡核苷酸中解析所述靶核酸；(e)提供所述至少第一组寡核苷酸和至少第二组寡核苷酸；和(f)组装所述至少第一组寡核苷酸和至少第二组寡核苷酸。

【技术特征摘要】
2013.11.27 US 61/909,5371.一种产生核酸文库的方法，所述方法包括：(a)鉴定靶核酸；(b)在所述靶核酸中鉴定第一区域，其中所述第一区域包含变体核酸序列；(c)在所述靶核酸中鉴定第二区域，其中所述第二区域包含非变体序列；(d)在包含所述变体核酸序列的至少第一组寡核苷酸和包含所述非变体核酸序列的至少第二组寡核苷酸中解析所述靶核酸；(e)提供所述至少第一组寡核苷酸和至少第二组寡核苷酸；和(f)组装所述至少第一组寡核苷酸和至少第二组寡核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸编码具有一个或多个结构域的多肽。3.如权利要求1所述的方法，其中，在提供步骤中，第一组寡核苷酸包含编码所述一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的缺失。4.如权利要求1所述的方法，其中，在提供步骤中，第一组寡核苷酸包含编码所述一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的插入。5.如权利要求1所述的方法，其中，在提供变体核酸序列的步骤中，第一组寡核苷酸包含编码所述一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的插入、编码所述一个或多个结构域的至少部分的核酸序列的缺失，或其组合。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸包含一个或多个恒定区。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸包含一个或多个可变区。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述文库采用基于聚合酶、基于连接酶或其组合的方式组装。9.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中，所述缺失或所述插入是3核苷酸的倍数。10.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·雅各布森，D·辛德勒，I·萨奥尔默，N·J·圭多，
申请(专利权)人：GEN九股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US