一种DNA文库及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种DNA文库及其构建方法与应用，具体涉及一种用于高通量测序的DNA文库及其构建方法与应用，属于基因高通量测序技术领域。本发明专利技术DNA文库的构建方法包括以下步骤：(1)提取孕妇外周血中的游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复，得到平末端DNA；(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头，混匀后加入预混液，再混合均匀；所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液；(4)进行连接反应，得到所述DNA文库。本发明专利技术DNA文库的构建过程中，加入接头混匀后再加入预混液，这样避免了正式连接反应之前DNA连接酶作用导致的DNA‑DNA无效连接，从而提高了有效连接的效率；采用本发明专利技术所述方法构建DNA文库后，建库成功率提高至98.58％。

A DNA Library and Its Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种DNA文库及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种DNA文库及其构建方法与应用，具体涉及一种用于高通量测序的DNA文库及其构建方法与应用，属于基因高通量测序

技术介绍
自从1997年卢煜明等首次发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)以来，人们对其研究不断加深。母体外周血中的胎儿游离DNA含量在5％-30％之间，人群中胎儿DNA含量呈正态分布。母体外周血中存在的胎儿游离DNA(cfDNA)可能来自于胎盘滋养层细胞脱落凋亡所产生的小分子DNA片段。外周血中母体DNA片段普遍大于胎儿DNA的片段，胎儿DNA片段长度大约在140-160bp之间，母体DNA普遍大于160bp。孕妇外周血中游离DNA平均长度约166bp。常见的染色体非整倍体疾病包括唐氏综合征(21-三体)，爱德华氏综合征(18-三体)和帕陶氏综合征(13-三体)。常见的染色体非整倍体疾病严重危害胎儿健康，给家庭和社会带来沉重负担。传统的唐氏血清学筛查染色体非整倍体的检出率在60％-80％之间，而且假阳性率较高，且存在一定的漏检率，筛查过程会给孕妇带来巨大的心理压力。胎儿染色体非整倍体筛查(NIPT)检测技术是近年来出现的运用高通量基因测序方法检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段，以评估胎儿常见染色体非整倍体(21-三体、18-三体及13-三体)异常风险。NIPT阳性检出率远高于传统的唐氏血清学筛查方法。由于该技术具有准确性高、检出率高等特点，并且孕妇不用进行穿刺，只需抽取孕妇外周血即可进行检测，避免了感染和流产风险。目前NIPT检测技术是孕妇产前筛查应用最为广泛的技术之一。NIPT实验室检测流程包括以下几步:1.提取孕妇外周血游离DNA；2.构建文库；3.定量和文库混合；4.高通量测序仪测序；5.数据分析。其中构建文库是NIPT检测过程中非常重要的一步，也是容易导致检测失败的一步。而接头连接又是构建文库的核心步骤，接头连接效率低会导致大量cfDNA-cfDNA或Adapter-Adapter无效连接，对检测结果造成影响。现有构建文库接头连接方法如下：1.1先将PCR管从普通PCR仪(或恒温金属浴)上取出放入冰盒。1.2根据样本个数，按下表1的比例计算ENZ2和BUF2的用量，配成预混液。表1组分加样量BUF225μLENZ2(T4DNA连接酶)1μL1.3充分混匀，瞬间离心5秒钟，将改预混液加入到步骤1.1已完成末端补平的PCR管中，再分别加入2μLAdapter于PCR管壁上，待全部加完后瞬间离心5秒钟，然后快速混匀，瞬间离心5秒钟并轻弹去除气泡，再瞬间离心5秒钟，放置于冰盒中，试剂的用量如下表2所示。表2组分加样量末端补平反应终体积49μLBUF2及ENZ2预混液26μLAdapter2μL反应终体积77μL1.4放入普通PCR仪(或恒温金属浴)中开始后续程序。上述现有方法存在以下问题：(1)该方法对所用孕妇cfDNA样本加入接头量为2μL。我们在实际操作中发现，由于每个孕妇cfDNA含量不同、接头量2μL的加入会导致cfDNA与Adapter比例过多或过少，影响建库效率，最终影响检测结果。(2)接头连接过程有效的连接是游离DNA分子与Adapter分子连接；避免DNA分子与DNA分子连接或Adapter与Adapter分子无效连接。而连接过程中使用的酶(ENZ2)为T4DNA连接酶，该酶可连接DNA-DNA粘性末端或平头末端，且该酶对所连接的分子无选择特异性。游离DNA分子经过末端修复过程成为平头末端，在连接酶和Buffer存在下容易发生自我连接。构建文库接头连接过程中，先加入预混液(ENZ2和BUF2)，再加入Adapter。预混液和加入Adapter之间有时间差，这时间会导致预混液中酶发挥功能，导致大量DNA-DNA发生无效连接，影响建库质量。最终影响NIPT检测结果。并且实验室手工接头连接实际过程中，由于同时处理多个样本，延长了每个样本预混液和加入Adapter之间的时间。实际操作过程中，延长的预混液和加入Adapter之间时间引起大量DNA-DNA无效连接，导致建库失败。在未改进的接头连接方法中，如若避免接头连接失败，需要两种方法：①加入预混液和Adapter时间要快速，减少预混液反应时间。但在实际操作过程中，由于同时多个样本进行实验，无法做到快速；而且快速也容易导致加样错误。②每个样本分别进行预混液-快速加入Adapter-混匀流程。该方法如若加入预混液后-快速加入Adapter，然后混匀，能有效避免无效连接。但在实际操作过程中试剂加入是在生物安全柜中进行，震荡离心是在生物安全柜以外地方进行。每个样本采有预混液-快速加入Adapter-混匀流程将导致浪费大量时间，效率低下。综上，NIPT过程中DNA文库的构建存在以下缺点：(1)没有根据cfDNA量确定加入的Adapter量，造成建库效率低下。(2)接头连接过程先加入预混液(ENZ2和BUF2)，造成大量DNA-DNA无效连接。(3)实际操作过程中，由于同时进行多个临床样本，该方法加剧了DNA-DNA之间的无效连接，导致建库失败。(4)在未改进的接头连接方法中，如若避免接头连接失败。加入Adapter需要快速，但同时处理多个样本，实际操作不可取，而且快速容易导致加样错误；而分别对每个样本进行整个流程需浪费大量时间，效率低下。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种建库成功率高的用于高通量测序的DNA文库的构建方法。同时，本专利技术提供了上述方法构建得到的DNA文库及其在高通量测序中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种DNA文库的构建方法，其包括以下步骤：(1)提取孕妇外周血中的游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复，得到平末端DNA；(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头，混匀后加入预混液，再混合均匀；所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液；(4)进行连接反应，得到所述DNA文库。本专利技术DNA文库的构建过程中，加入接头混匀后再加入预混液，这样避免了正式连接反应之前DNA连接酶作用导致的DNA-DNA无效连接，从而提高了有效连接的效率。研究表明，按照现有方法构建DNA文库，建库成功率仅有71.03％；采用本专利技术所述方法构建DNA文库后，建库成功率提高至98.58％。本专利技术所提供的DNA文库的构建方法，仅通过改变试剂加入的先后顺序，使得建库成功率大幅度提高，这是本领域的技术人员难以预料到的。同时，采用本专利技术方法构建DNA文库，加样时无需快速，可以保证加样的准确性。该方法实际操作可行，有效，时间可以充分利用。作为本专利技术所述DNA文库的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，采用血清游离DNA提取试剂盒提取孕妇外周血中的游离DNA。作为本专利技术所述DNA文库的构建方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，DNA连接酶为T4DNA连接酶。作为本专利技术所述DNA文库的构建方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为(50～300):1。更优选地，所述步骤(3)中，接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为100:1。根据不同孕妇外周血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取孕妇外周血中的游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复，得到平末端DNA；(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头，混匀后加入预混液，再混合均匀；所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液；(4)进行连接反应，得到所述DNA文库。

【技术特征摘要】
1.一种DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取孕妇外周血中的游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复，得到平末端DNA；(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头，混匀后加入预混液，再混合均匀；所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液；(4)进行连接反应，得到所述DNA文库。2.如权利要求1所述的DNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用血清游离DNA提取试剂盒提取孕妇外周血中的游离DNA。3.如权利要求1所述的DNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，DNA连接酶为T4DNA连接酶。4.如权利要求1所述的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢小雷，
申请(专利权)人：谢小雷，
类型：发明
国别省市：广东,44