用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备技术

本发明专利技术一般地涉及分子条码标记和基于乳液的微流体技术的组合从而以高通量方式从单个细胞分离、裂解、条码标记和制备核酸。

Microdrop based methods and equipment for complex single cell nucleic acid analysis

The invention generally involves molecular bar code labeling and emulsion based microfluidics technology, so that it can separate, cleavage, barcode and prepare nucleic acids from single cells in a high flux way.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备相关申请和通过引入并入本申请要求2014年9月9日提交的美国临时专利申请系列号62/048,227、2015年4月13日提交的美国临时专利申请系列号62/146,642的权益和优先权。前述申请以及在其中或在其审查过程中引用的所有文件(“申请引用文件”)和在所述申请引用文件中引用或参考的所有文件，以及在本文中引用或参考的所有文件(“本文引用文件”)和在所述本文引用文件中引用或参考的所有文件，与在本文中或通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的指示、说明、产品说明书和产品插页一起由此通过并入本文，且可以用于实施本专利技术。更具体地，所有参考的文献通过引用并入达到如同各单个文献特别地和单独地表明通过引用并入的相同程度。
本专利技术一般地涉及分子条码标记和基于乳液的微流体技术的组合，从而以高通量方式从单个细胞分离、裂解、条码标记和制备核酸。联邦资助说明本专利技术利用国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)提供的合同号HG006193的政府支持完成。政府对本专利技术具有一定权利。
技术介绍
细胞以不同的类型、亚型和活性状态存在，申请人基于其形状、位置、功能或分子谱(如它们表达的RNA的集合)来分类。RNA谱型分析(profiling)在原则上是特别富信息量的，因为细胞表达数以千计的不同RNA。测量例如每种类型的RNA的水平的方法直到最近仍一直应用于“均质的”样品-其中所有细胞的内容物混合在一起。这极大地限制了我们利用这样的技术了解人组织功能和病理(例如，在脑中)的能力。在过去的两年中，已经开始出现在单一细胞中进行这些测量的新技术，但它们还未扩展到大量的细胞，且是非常昂贵的。在此，申请人开发了快速地和经济地确定数以万计的单个人细胞(包括来自脑组织的细胞)的RNA内容物的谱特征的方法。为做到这一点，申请人采用特殊的微流体装置以将各细胞包封在单个液滴中，将各细胞的RNA与对于该细胞/液滴独特的“细胞条码”相关联，用测序测量各RNA的表达水平和然后利用细胞条码确定各RNA分子来自于哪个细胞。申请人可以使用这一方法来更好地了解几乎任何生物样品；特别重要的是了解来自任何复杂组织(例如视网膜)的样品。进行需要单细胞(或单分子)水平的数据解析的研究在最好的情况下也可能是挑战性的或受到成本过高的限制。虽然存在着用于单分子或单细胞分析的技术或仪器(例如，分别地数字聚合酶链反应(PCR)或FluidigmC1)，但目前没有一种技术或仪器允许用于动态递送试剂和/或对单个反应附加分子“信息”的可扩展方法，以使得可以共同地处理和分析大量的反应/试验而同时仍然保持按照单个反应/试验划分结果的能力。微流体技术涉及操作少量流体的微尺度装置。因为微流体技术可以精确地和可再现地控制和分配小流体体积，特别是小于1μl的体积，微流体技术的应用提供显著的成本节约。微流体技术的使用减少了循环时间，缩短了得到结果的时间(time-to-results)和增大了通量。此外，微流体技术的整合增强了系统集成和自动化。微流体反应一般在微液滴(microdroplet)中进行。在微液滴中进行反应的能力依赖于能够合并不同的样品流体和不同的微液滴。参见，例如，美国专利公开No.20120219947。微滴(droplet)微流体技术对于进行高通量筛选和灵敏的分析提供了显著的优势。微滴允许样品体积显著减小，导致成本的随之降低。以千赫兹速度进行的操作和测量使得能够在一天内筛选最多108个独立的生物实体(包括，但不限于单个细胞或细胞器)。在微滴中的区室化通过提高稀有物质的有效深度和减少达到检测阈值所需的时间来提高试验灵敏度。微滴微流体技术将这些有力的特征相结合以使得能够实现目前达不到的高通量筛选应用，包括单细胞和单分子分析。参见，例如，Guo等，LabChip，2012，12，2146-2155。本申请中任何文献的引用或确认并不是承认该文献可是用作本专利技术的现有技术。
技术实现思路
本专利技术特别地涉及分子条码标记和基于乳液的微流体技术的组合，从而以高通量方式从单个细胞分离、裂解、条码标记和制备核酸。本专利技术提供高通量单细胞RNA-Seq和/或靶核酸谱型分析(例如，测序、定量反转录聚合酶链反应等等)，其中来自不同细胞的RNA单独地加标签，从而允许建立单一文库而同时保持各阅读片段的细胞身份。使用了分子条码标记和基于乳液的微流体技术的组合而以高通量从单个细胞分离、裂解、条码标记和制备核酸。微流体装置(例如，用聚二甲基硅氧烷制造的)，亚纳升反相乳液微滴。这些微滴用于共包封核酸与条码标记的捕获珠。例如，各珠独特地条码标记以使得各液滴及其内容物是可区分的。核酸可以本领域中已知的任何来源，例如，来自单细胞、细胞对、细胞裂解产物或溶液的那些。细胞在被包封在微滴中时裂解。为将单一细胞和条码标记的珠以泊松统计加载到这些微滴中，需要100,000至1千万个这样的珠以条码标记～10,000-100,000个细胞。本专利技术提供用于建立单细胞测序文库的方法，包括：将一个独特地条码标记的mRNA捕获微珠与75-125μm直径的乳液微滴中的单细胞合并；裂解细胞以使得其RNA可供通过杂交到RNA捕获微珠上而捕获；在乳液微滴内部或外部进行反转录以将细胞的mRNA转换为第一链eDNA，其共价连接于mRNA捕获微珠；汇合来自所有细胞的cDNA-附着的微珠；和制备和测序单一复合RNA-Seq文库。本专利技术提供用于制备独特地条码标记的mRNA捕获微珠的方法，该mRNA捕获微珠具有独特的条码和适合于微流体装置的直径，该方法包括：1)在珠的表面上以汇合-和-分割方式进行反向亚磷酰胺合成，以使得在各个合成循环中，所述珠分割到具有四种规范核苷酸(canonicalnucleotide)(T、C、G或A)之一或长度两个或更多个碱基的独特寡核苷酸的四个反应之一中；2)重复这一过程许多次，至少两次和最佳地超过十二次，以使得在后一种情况中在池中的各珠的表面上存在超过1600万独特的条码。(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC206447)一般地，本专利技术提供用于制备大量具有独特核酸条码的珠、颗粒、微珠、纳米颗粒等的方法，包括以汇合-和-分割方式在珠的表面上进行多核苷酸合成，以使得在各个合成循环中，珠分割成经历不同的化学反应的亚集；和然后在两个或更多个循环中重复这一分割-汇合过程以组合地产生大量的不同核酸条码。本专利技术进一步提供进行多核苷酸合成，其中所述合成可以是本领域技术人员已知以逐步方式“构建”多核苷酸序列的任何类型的合成。实例包括，但不限于利用亚磷酰胺化学过程的反向合成或利用具有亚磷酰胺化学过程的正向合成。之前和公知的方法单独地合成寡核苷酸，然后将整个所需序列酶促“粘结”到珠上。申请人提出了复合的珠和用于产生这些珠的新方法，其中核苷酸以高通量方式化学构建到珠材料上。此外，申请人总体描述了递送一“包”的珠，其允许递送数百万序列到单独的区室中和然后一次性筛选所有序列。本专利技术进一步提供用于通过微流体系统建立单细胞测序文库的设备，包括：包含过滤器和载体流体通道的油-表面活性剂入口，其中所述载体流体通道还包括阻流体(r本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷酸‑或寡核苷酸‑装饰的珠，其中所述珠包含：(a)连接体；(b)用作测序引发位点的相同序列；(c)均一或近均一的核苷酸或寡核苷酸序列；(d)对于各引发位点不同的独特分子标识；(e)任选地用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸冗余序列；和(f)任选地至少一个另外的寡核苷酸条码，其提供用于鉴别的另外的基质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.09 US 62/048,227;2015.04.13 US 62/146,6421.一种核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述珠包含：(a)连接体；(b)用作测序引发位点的相同序列；(c)均一或近均一的核苷酸或寡核苷酸序列；(d)对于各引发位点不同的独特分子标识；(e)任选地用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸冗余序列；和(f)任选地至少一个另外的寡核苷酸条码，其提供用于鉴别的另外的基质。2.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述珠的表面上的核苷酸或寡核苷酸序列是分子条码。3.根据权利要求2的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述条码长度范围为4-1000个核苷酸。4.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸序列是寡聚dT序列。5.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是不可切割的直链聚合物。6.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是可化学切割的直链聚合物。7.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是不可切割的任选取代的烃聚合物。8.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是光不稳定的任选取代的烃聚合物。9.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是聚乙二醇。10.根据权利要求1的核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠，其中所述连接体是PEG-C3至PEG-24。11.一种包含多个核苷酸-或寡核苷酸-装饰的珠的混合物，其中所述珠包含：(a)连接体；(b)用作测序引发位点的相同序列；(c)均一或近均一的核苷酸或寡核苷酸序列；(d)对于各引发位点不同的独特分子标识；(e)用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸冗余序列；和(f)任选地至少一个另外的寡核苷酸条码，其提供用于下游分子-生物反应的基质；其中所述均一或近均一的核苷酸或寡核苷酸序列对于任一个珠上的所有引发位点是相同的，但在单个珠上的寡核苷酸之间发生变化。12.根据权利要求11的混合物，其中所述珠的表面上的所述核苷酸或寡核苷酸序列是分子条码。13.根据权利要求12的混合物，其中所述条码长度范围为4-1000个核苷酸。14.根据权利要求11的混合物，其中所述用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸序列是寡聚dT序列。15.根据权利要求11的混合物，其包含至少一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列提供用于下游分子-生物反应的基质。16.根据权利要求11的混合物，其中所述下游分子-生物反应是用于成熟mRNA的反转录；捕获转录组的特定部分、DNA聚合酶和/或相似酶的启动；或在整个转录组或基因组中启动。17.根据权利要求11的混合物，其中所述另外的寡核苷酸序列包含寡聚dT序列。18.根据权利要求11的混合物，其中所述另外的寡核苷酸序列包含引物序列。19.根据权利要求11的混合物，其中所述另外的寡核苷酸序列包含寡聚dT序列和引物序列。20.一种误差校正条码珠，其中所述珠包含：(a)连接体；(b)用作测序引发位点的相同序列；(c)均一或近均一的核苷酸或寡核苷酸序列，其包含至少核苷酸碱基重复；(d)对于各引发位点不同的独特分子标识；和(e)用于捕获聚腺苷酸化mRNA和启动反转录的寡核苷酸冗余。21.一种方法，其中权利要求20的条码珠不能与所述mRNA杂交，从而不能发生反转录。22.一种试剂盒，其包含权利要求1的寡核苷酸结合珠和权利要求20的自身校正条码珠的混合物。23.一种用于建立复合单细胞测序文库的方法，包括：(a)将一个独特地条码标记的RNA捕获微珠与50μm-210μm直径的乳液微滴中的单细胞合并；(b)裂解所述细胞，从而在所述RNA捕获微珠上捕获所述RNA；(c)进行反转录反应以将所述细胞的RNA转换为第一链cDNA，其共价连接于所述RNA捕获微珠；或在微滴内逆向地反转录且随后破坏微滴和收集cDNA-附着的珠；(d)制备和测序单一复合RNA-Seq文库，含有记录各RNA的细胞来源的细胞条码和区分来自相同细胞的RNA的分子条码。24.一种用于建立复合单细胞测序文库的方法，包括：(a)将一个独特地条码标记的RNA捕获微珠与50μm-210μm直径的乳液微滴中的单细胞合并；(b)裂解所述细胞，从而在RNA捕获微珠上捕获所述RNA；(c)破坏微滴并汇合溶液中的珠；(d)进行反转录反应以将所述细胞的RNA转换为第一链cDNA，其共价连接于所述RNA捕获微珠；或在微滴内逆向地反转录且随后破坏微滴和收集cDNA-附着的珠；(e)制备和测序单一复合RNA-Seq文库，其含有记录各RNA的细胞来源的细胞条码和区分来自相同细胞的RNA的分子条码。25.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中扩增所述cDNA-附着的珠的方法是模板转换扩增。26.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中扩增所述cDNA-附着的珠的方法是T7线性扩增。27.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中扩增所述cDNA-附着的珠的方法是指数式恒温扩增。28.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中所述乳液微滴通过包含RNA捕获微珠和复合单细胞的共包封形成。29.根据权利要求25的方法，其中所述乳液微滴是所述RNA捕获微珠的体积的至少1.25倍。30.根据权利要求29的方法，其中所述乳液微滴是所述RNA捕获微珠的体积的至少1.5倍。31.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中所述RNA是mRNA。32.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中所述乳液微滴的直径是125μm。33.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中所述RNA捕获微珠的直径是10μm-95μm。34.一种用于制备具有独特核酸序列的多个珠的方法，包括：(a)在汇合-和-分割过程中在所述多个珠的表面上进行多核苷酸合成，以使得在各个合成循环中，所述珠分割成多个亚集，其中各亚集经历不同的化学反应；(b)重复所述汇合-和-分割过程2-200个循环中任一次数的循环。35.根据权利要求34的方法，其中所述多核苷酸合成是亚磷酰胺合成。36.根据权利要求34的方法，其中所述多核苷酸合成是反向亚磷酰胺化学过程。37.根据权利要求34的方法，其中各亚集经历不同的核苷酸。38.根据权利要求34的方法，其中各亚集经历不同的规范核苷酸。39.根据权利要求34的方法，其中重复三次。40.根据权利要求34的方法，其中重复四次。41.根据权利要求34的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·雷格夫，E·Z·麦科斯科，S·A·麦卡罗尔，A·K·沙勒克，A·巴苏，C·B·福特，H·帕克，D·A·韦茨，
申请(专利权)人：博德研究所，哈佛学院院长等，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国,US