本发明专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种利用聚合酶扩增技术，从水芹品种‘溧阳白芹’中克隆出与品质相关的Magnesium‑protoporphyrin IX monomethyl ester(MPE)基因的方法。‘溧阳白芹’植株经黑暗处理后，可获得含有丰富营养物质的鲜嫩叶柄及叶片，所述基因与‘溧阳白芹’品质相关，参与叶绿素代谢。本发明专利技术公开了一种水芹品种‘溧阳白芹’中，与品质相关MPE基因的克隆方法。
Cloning and application of a quality related MPE gene in \Liyang parsley\
The invention belongs to the field of molecular biology and gene engineering, relates to an amplification using polymerase, cloning and quality related Magnesium protoporphyrin IX monomethyl ester from cress cultivar 'Liyang white celery' (MPE) gene. After the dark treatment, the Liyang white parsley plant can get fresh petiole and leaf with rich nutrients. The gene is related to the quality of Liyang Bai Qin and is involved in chlorophyll metabolism. The invention discloses a cress cultivar 'Liyang white celery', cloning method and quality related gene MPE.
【技术实现步骤摘要】
一种‘溧阳白芹’中与品质相关MPE基因的克隆方法及其应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种利用聚合酶扩增技术，从水芹品种‘溧阳白芹’中，克隆与品质相关的MPE基因方法。‘溧阳白芹’植株经黑暗处理后，可获得含有丰富营养物质的鲜嫩叶柄及叶片，所述基因与‘溧阳白芹’品质相关，参与叶绿素代谢。本专利技术公开了一种水芹品种‘溧阳白芹’中，与品质相关MPE基因的克隆方法。
技术介绍
‘溧阳白芹’为伞形科水芹属水生宿根多年生草本植物。‘溧阳白芹’性喜冷凉，叶片黄绿色，叶柄为青绿色，为水芹的优良品种之一。‘溧阳白芹’具有清热解毒、消热利尿、抗炎降压等保健功能，是我国江苏省溧阳市特色蔬菜之一。叶绿素(Chlorophyll)是植物细胞叶绿体中一类极重要的绿色素，叶绿光中吸收能量，从而将光能转变为化学能供给植物生长(Zhangetal.，J.PlantPhysiol2011，168：2081-2087)。光照不足时，植株叶绿素降解加剧，影响植物生长发育，进而影响作物的产量和品质(S.TrendsinPlantScience，2009，14(3)：155-162)。暗处理，普遍用于软化韭黄、姜芽等一些蔬菜作物，可改善蔬菜作物适口性及提高营养品质(Mutuietal.，PlantGrowthRegulation，2007，53(2)，87-96；S.AnnualReviewofPlantBiology，2006，57：55-77)。‘溧阳白芹’在黑暗条件下，抽生嫩白的新叶柄和叶片，含有丰富营养物质，如维生素和无机盐等。叶绿素代谢过程包括：叶绿素合成、转化、分解，而MPE(Magnesium-protoporphyrinIXmonomethylester)基因参与调节叶绿素合成过程(Gadjievaetal.，PlantPhysiology&Biochemistry，2005，43(43)：901-8)。‘溧阳白芹’植株经黑暗处理后，可获得含有丰富营养物质的鲜嫩叶柄及叶片。黑暗处理，使得‘溧阳白芹’植株迅速伸长，茎叶细长，木质化程度降低，结构松软而脆弱。纤维素的含量降低，而水分含量增加，给人以柔嫩多汁的口感，满足人们对蔬菜品质的要求。‘溧阳白芹’在黑暗处理过程中，因不能进行叶绿素的合成，外观白嫩鲜黄，使其商品品质得以提高。研究叶绿素的代谢情况，对于进一步研究‘溧阳白芹’品质具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种从‘溧阳白芹’中，克隆与品质相关MPE基因的方法及其该基因的应用。所获得的MPE基因在黑暗处理过程中，参与调节叶绿素的代谢活动，可应用于‘溧阳白芹’的品质研究中。该方法包括：‘溧阳白芹’总RNA的提取及cDNA的合成，‘溧阳白芹’MPE基因的扩增、回收、连接、转化与筛选，测序基因序列组装与分析，荧光定量引物设计，MPE基因的表达水平分析，叶绿素含量变化测定。附图说明图1.RT-PCR克隆‘溧阳白芹’基因MPE。M：分子量标准Marker；1：MPE基因图2.‘溧阳白芹’中MPE基因在黑暗处理过程中的表达水平。图3.黑暗处理过程中‘溧阳白芹’叶绿素含量的变化。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施操作。具体实验步骤如下：1.‘溧阳白芹’总RNA的提取采用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取黑暗处理0、4、8、12、16、20d的叶片中的总RNA，利用PrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa，大连)提取各阶段叶片的总RNA。2.cDNA的合成用琼脂糖凝胶电泳和NanodropND-100超微分光光度计(NanoDrop，美国)分别测定RNA的纯度和含量，用gDNAEraser(TaKaRa，大连)42℃处理2min去除总RNA中基因组DNA污染。根据PrimeScriptRT反应试剂盒(TaKaRa，大连)的步骤合成cDNA，将cDNA稀释15倍用于荧光定量PCR反应及其基因克隆。3.‘溧阳白芹’MPE基因的扩增基于水芹转录组测序信息，获得水芹MPE的基因序列，设计引物。正向：5’-ATGGCAGCAGAAATGGCTCTAGTA-3’，反向5’-CTAGTAAACAAGTTGGGTTTCAAAC-3’。以‘溧阳白芹’cDNA为模板进行扩增目的片段，反应体系为20μL：10μLTaq酶，7μLddH2O，cDNA模板、前后引物各1μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min。4.‘溧阳白芹’MPE基因的回收、连接和转化。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，将目的条带，切割下来，利用康宁生命科学(吴江)有限公司的AxyPrepTMDNAGelExtractionKit250-prep试剂盒说明书进行回收。连接反应采用5μL体系：2.5μLSolutionone+0.5μLPMD19+2μL回收产物。在PCR仪中16℃连接2.5h。随后，将连接产物利用42℃热击(1min)的方法，转化到大肠杆菌DH5α中。冰浴10min后，加入无抗性的LB液体培养基700μL，置于37℃摇床中，220rpm/min，复苏1h。5.单菌落筛选。将复苏好的菌液，12000rpm/min离心机离心5min，去除上清液，保留120μL底部菌液。于超净工作台上，使用200μL移液枪将菌液混匀，涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基中。倒置放入37℃的培养箱中，培养12～14h。挑取单菌落，转移至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，重复挑取5个菌落，置于37℃摇床中，220rpm/min培养6～7h。6.菌液检测。以反应所得菌液为模板，利用PCR仪进行检测。反应体系为10μL体系：5μLTaq酶，3.5μL的ddH2O，菌液、前后引物各0.5μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃90s，共35个循环；72。℃10min。利用凝胶电泳检测是否为目的条带。确认获得目的条带后，将选择3管菌液送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。7.测序基因序列组装与分析。通过核苷酸序列测定，获得了‘溧阳白芹’MPE基因的序列，利用BioXM2.6软件对其基因序列进行组装与分析，从而获得该基因的序列。最后，将获得的基因序列导入NCBIBLAST中进行序列比对，验证所获基因序列是否正确。8.根据测序结果，设计定量引物。对生长两个月‘溧阳白芹’植株，分别进行0、4、8、12、16、20d的黑暗处理。每次取样均取同一生长势的叶片，暗处理的样品均以未经暗处理的植株作为对照。各阶段的试验材料取下后用液氮速冻，转入-80℃冰箱中保存。根据‘溧阳白芹’中扩增的MPE基因序列设计表达检测引物，正向为5’-TCACGCTTCTTCTGCTTATCGGTCT-3’，反向为5’-GTGTTAATCTCCACCATCCTGTCCA-3’。9.‘溧阳白芹’MPE基因的表达水平分析。实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR)采用BioRadCFX96Real-timeSystem和BioRadCFXManager完成。实时荧光定量PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从水芹品种‘溧阳白芹’中获得MPE基因的方法；
【技术特征摘要】
1.一种从水芹品种‘溧阳白芹’中获得MPE基因的方法；2.权利要求1所述的水芹品种‘溧阳白芹’中的MPE基因的序列；3.权利要求1所述的水芹品种‘...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊爱生，张馨月，谭国飞，王枫，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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