在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法技术

本发明专利技术涉及一种在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法：a)设计带突变位点的引物A和与之紧邻的反向引物B；b)多聚核苷酸激酶分别磷酸化A和B的5'末端；c) 选用无5'‑3'外切核酸酶活性且扩增产物3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶进行PCR扩增，将所得目的片段通过琼脂糖凝胶进行回收；d) DNA连接酶环化回收产物并转入感受态细胞，筛选突变质粒。本发明专利技术的优点在于，通过对引物5'末端进行磷酸化，提高线型突变体自身环化的效率；通过选择特殊DNA聚合酶，保证了扩增片段上突变位点的稳定性。本方法可实现在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、高效地定点突变，并且能同时适用于甲基化和非甲基化的DNA模板，在11kb左右的质粒上单点突变阳性率高达87%以上。

A method to realize fixed point mutation on the 10KB ring DNA molecule

【技术实现步骤摘要】
在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法
本专利技术属于分子生物学
，具体地说是一种在大于10kb的环状DNA大分子上高效稳定实现定点突变的方法。
技术介绍
体外定点突变技术在分子生物学领域是十分重要的研究方法，该方法通过改变DNA序列上特定位点的碱基序列，结合相关分析，有助于阐明包括单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点在内的碱基突变对基因乃至蛋白质结构和功能的影响，有助于揭示启动子调节基因的靶向位点，也有助于阐明基因变异对疾病的影响及可能的影响机制。目前已有报道的、用于在DNA序列中引入点突变的方法大致可分为酶切位点依赖型定点突变和PCR介导的定点突变两大类。酶切位点依赖型定点突变适用于突变位点附近含有合适的限制性内切酶识别位点的情况，该方法通过核酸内切酶将DNA序列切割成线性化的特异性片段，然后重新连接入新的载体序列，最终通过一系列的筛选程序得到正确的目的突变克隆。这种方法操作复杂，受突变位点周围序列影响较大，因此不能适用于所有突变实验。PCR介导的定点突变最早由Horton等人在1989年首次报道，它通过包含一个或多个错配碱基的突变引物直接引入突变，具有突变引入高效、不受待突变碱基周围序列影响、价格低廉、操作简单、快速等优点，而且经过发展改进，该技术得到了良好的派生，例如形成了重叠延伸PCR（overlapextensionPCR，OE-PCR）、大引物PCR（megaprimerPCR）、不对称重叠延伸PCR（asymmetricaloverlapextensionPCR，AOE-PCR）等多种PCR介导的定点突变方法。基于上述定点突变技术的积累，目前用于环状DNA分子定点突变的常用方法有：1）以甲基化的环状DNA作为模板，设计互补的带突变位点引物对，使用非甲基化dNTP进行PCR扩增后将混合物全部转化进甲基化酶缺陷型大肠杆菌后，甲基化的模板DNA分子复制受到抑制，而有两个开口的非甲基化双链环状突变体DNA可以复制生成完整的双链环状突变体，最终筛选得到突变后的质粒；2）以非甲基化的环状DNA作为模板，设计一条带突变位点的引物，在PCR反应体系中使用甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤分别替代正常的胞嘧啶和腺嘌呤，然后用甲基化敏感性限制性内切酶消化PCR产物混合物，使得非甲基化的模板DNA被消化而包含甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤的突变体DNA被保留，最后将消化产物转入大肠杆菌感受态细胞进行筛选鉴定；3）以甲基化的环状DNA作为模板，设计一条带突变位点的引物，在PCR反应体系中使用非甲基化dNTP并按照一定比例同时加入高温DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增，然后利用只识别并切割甲基化DNA的限制性内切酶DpnI消化掉混合物中的模板DNA，最后将环状单链DNA突变体得到保留的消化产物转入大肠杆菌感受态细胞进行复制，最终得到突变后的质粒。上述三种方法各有优点，方法1）不需要花费额外步骤消化模板DNA，可以省力、省时，同时高效的完成定点突变；方法2）高效的适用于非甲基化的环状DNA模板；方法3）适用于甲基化的环状DNA模板；且方法2）和方法3）都不受所用感受态细胞是否为甲基化缺陷型的限制。但是，它们也存在着共同的缺点，如：对于10kb以上的环状子大分子DNA突变效率低，不能通用于甲基化和非甲基化环状DNA模版。此外，方法1）需要额外购买甲基化酶缺陷型大肠杆菌；方法2）需要额外购买甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤以及甲基化敏感性限制性内切酶；方法3）需要购买限制性内切酶DpnI；增加实验限制和花费，需要较高成本才能完成定点突变实验。因此，专利技术一种能够稳定高效地适用于10kb以上的环状DNA大分子、且同时适用于甲基化和非甲基化DNA模板的定点突变方法必要且亟需。
技术实现思路
目前已有的环状DNA分子定点突变方法均只能在小于5kb大小的DNA片段上有效操作，针对大片段（特别是大于10kb）尚无稳定的人工定点突变方法。本专利技术提供了一种可在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、快速、高效、节约地实现定点突变的方法，且该方法可同时适用于甲基化和非甲基化的环状DNA分子。本专利技术的技术步骤为：a)设计带突变位点的突变引物A和与之紧紧相邻的反向引物B；b)用多聚核苷酸激酶按照引物磷酸化条件分别磷酸化引物A和B的5'末端；c)在大于10kb的环状DNA大分子模板上，使用特殊DNA聚合酶按照优化后的PCR条件进行扩增，并通过琼脂糖凝胶对目的片段进行精确回收；d)用DNA连接酶对回收产物进行自身环化反应后转入高效感受态细胞，筛选目的突变质粒。步骤a)在设计引物时，要保证引物A和引物B的5'端紧紧相邻，3'端方向相反，并且用突变后的碱基替代引物A所对应模板DNA的碱基。步骤b)中所用的多核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)。步骤b)中所述的引物磷酸化条件为：每磷酸化150pmol引物需要1个活力单位T4多聚核苷酸激酶和10nmolATP，具体的反应体系为：100µM引物7.5µl，T4polynucleotidekinaseReactionBuffer(10×)1µl，10mMATP1µl，10units/µlT4polynucleotidekinase0.5µl，37℃反应1h。步骤b)中磷酸化反应后的引物不必回收和纯化，但必须65℃热失活20min，用于失活T4polynucleotidekinase，然后加入65µl去离子水将引物浓度稀释至10µM后直接用于PCR反应。步骤c)中的所述的大于10kb的环状DNA大分子模板可以是甲基化或非甲基化DNA。步骤c)中使用的特殊DNA聚合酶为：有3'-5'外切核酸酶活性，无5'-3'外切核酸酶活性，扩增产物的3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶。步骤c)中PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，以“引物平均Tm值加4℃”作为退火温度退火30s，以“模板长度kb值除以3”作为延伸时间（min）进行72℃延伸，反应30个循环后72℃再延伸7min。步骤c)中精确回收的扩增产物需溶解于去离子水中。步骤d)中的DNA连接酶为T4DNAligase。步骤d)中每50ng扩增产物的自身环化需加入50ng扩增产物和5个活性单位的T4DNAligase。本专利技术的核心优点之一是稳定地适用于大分子环状DNA上的定点突变，本专利技术设计了对引物的5'末端寡核苷酸进行磷酸化，使得含突变位点的目的片段末端磷酸化效率大大提高，极大地提高了线状目的片段自身环化的成功率，从而能有效提高在大分子环状DNA上的点突变成功率，例如，我们对于8kb左右的质粒单点突变阳性率高达91%以上，对于11kb左右的质粒单点突变阳性率达87%以上；优点之二是通用于甲基化和非甲基化的DNA模板，本专利技术使用切胶回收的方式来分离环状模板DNA和PCR扩增的线状DNA突变体，可以使模板DNA不受是否甲基化的限制，同时也不受是否具备甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤、是否具备甲基化敏感性限制性内切酶、是否具备限制性内切酶DpnI或甲基化酶缺陷型大肠杆菌等实验条件的限制；所有实验步骤操作简单、快速，至转化感受态细胞以前的所有实验只需一天时间就可以完成，且方法稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法，其核心特征为：用T4多聚核苷酸激酶分别磷酸化带突变位点的成对引物，在大于10kb的环状DNA大分子模板上，使用特殊DNA聚合酶按照优化后的PCR条件进行扩增，环化线型扩增产物并转入感受态细胞后最终得到点突变质粒。

【技术特征摘要】
1.在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法，其核心特征为：用T4多聚核苷酸激酶分别磷酸化带突变位点的成对引物，在大于10kb的环状DNA大分子模板上，使用特殊DNA聚合酶按照优化后的PCR条件进行扩增，环化线型扩增产物并转入感受态细胞后最终得到点突变质粒。2.按照权利要求1所述的方法，其特征1是：所述的磷酸化是使用T4多聚核苷酸激酶按照引物磷酸化条件分别磷酸化引物对的5'末端。3.按照权利要求1所述的方法，其特征2是：所述的环状DNA大分子为大于10kb的环状甲基化DNA或环状非甲基化DNA。4.按照权利要求1所述的方法，其特征3是：所述的特殊DNA聚合酶是有3'-5'外切核酸酶活性，无5'-3'外切核酸酶活性，扩增产物的3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶。5.按照权利要求1所述的方法，其特征4是：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑冰蓉，陈国栋，焦扬，郭皓，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53