一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸及其应用，该寡聚核酸分为三类，核心序列分别为RGGGAHTTYCS、TTYSGGAAWT和TTTCSCGCS，其中，R为G或A；H为A或C或T；Y为C或T；S为C或G；W为A或T。上述寡聚核酸还包括其反义链和修饰型。经本发明专利技术的寡聚核酸对体内外肿瘤生长有抑制作用，有望用于制备抑制肿瘤生长的药物，专一性高，抑制率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸及其应用。
技术介绍
寡聚核酸可分为反义核酸、小干扰RNA、适配体、微小RNA、DECOY核酸等，按作用靶点与机制的不同，发挥其各自生物学功能。作为治疗药物的寡聚核酸已在美国获批上市，同时进行临床研究的也有数十个品种，随着生物技术、药物筛选与制备等技术的进步，越来越多的有特定功能的寡聚核酸被发现，并被开发和应用于治疗、预防和诊断各种疾病。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸及其应用，通过对系列寡聚核酸OligodsDNA的筛选和抑癌活性评价试验，发现了序列1～序列10的寡聚核酸对体内外肿瘤生长有抑制作用。技术方案：为实现上述技术目的，本专利技术提供一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸，其特征在于，所述寡聚核酸为下述序列1～10中的任意一种：序列1：5`-CTTGAGGGGAATTTCCCAG-3`序列2：5`-GAGAGGGGACTTTCCGAGAG-3’序列3：5`-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3`序列4：5’-GCCATTTCCGGGAATTGCTA-3’序列5：5’-AGTTCTGGGAATTCC-3’序列6：5’-AGTCATTTCCGGGAAATGACT-3’序列7：5’-TGACTATTTCCCGCGACTT-3’序列8：5’-TTGACTATTTCCCGCCACTT-3’序列9：5’-ATCTATTTCGCGCCCTTATG-3’序列10：5’-TTAAGTTTCGCGCCCTTTCTC-3’。所述的寡聚核酸还可以为上述序列1～10的反义链。作为另一种实施方案，所述的寡聚核酸为上述的寡聚核酸的修饰型。具体地，所述的修饰型为特别位点硫代化修饰；或两端各3个核苷酸硫代化修饰；或全硫代修饰。优选地，对应各个序列的修饰的位点如下：序列1(正)：5’-CTTGAGGGGAATTTCCCAG-3’序列2(正)：5’-GAGAGGGGACTTTCCGAGAG-3’序列3(正)：5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’序列4(正)：5’-GCCATTTCCGGGAATTGCTA-3’序列5(正)：5’-AGTTCTGGGAATTCC-3’序列6(正)：5’-AGTCATTTCCGGGAAATGACT-3’序列7(正)：5’-TGACTATTTCCCGCGACTT-3’序列8(正)：5’-TTGACTATTTCCCGCCACTT-3’序列9(正)：5’-ATCTATTTCGCGCCCTTATG-3’序列10(正)：5’-TTAAGTTTCGCGCCCTTTCTC-3’其中，正表示即仅列出正义链，反义链略。本专利技术同时提出了上述寡聚核酸在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。具体地，包括如下步骤：将所述的寡聚核酸经HPLC纯化，灭菌水配制成浓度1～2mg/mL后，将该寡聚核素与其反义链进行等摩尔数混合、水浴加温至80～85℃10～15分钟，自然冷却至室温，退火结合成双链用于制备抑制肿瘤生长的药物。其中，所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌和胰腺癌中的任意一种。有益效果：本专利技术提供的寡聚核酸对体内外肿瘤生长有抑制作用，有望用于制备抑制肿瘤生长的药物，专一性高，抑制率高。附图说明图1为序列5(KT17)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的示意图；图2为序列5(KT17)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用的示意图；图3为为序列5(KT17)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的照片；图4为核酸序列8(KT59)对人胰腺癌细胞CFPAC-1裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的示意图；图5为核酸序列1(KT32)对人肺癌细胞NCI-H1975裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用的示意图。具体实施方式本专利技术提供的寡聚核酸主要分三类，共计10个序列，具体如下：第一类：主要由核心序列RGGGAHTTYCS所组成的OligodsDNA包括：序列1(正)：5’-CTTGAGGGGAATTTCCCAG-3’序列2(正)：5’-GAGAGGGGACTTTCCGAGAG-3’序列3(正)：5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’第二类：主要由核心序列TTYSGGAAWT所组成的OligodsDNA，包括：序列4(正)：5’-GCCATTTCCGGGAATTGCTA-3’序列5(正)：5’-AGTTCTGGGAATTCC-3’序列6(正)：5’-AGTCATTTCCGGGAAATGACT-3’第三类：主要由核心序列TTTCSCGCS所组成的OligodsDNA，包括：序列7(正)：5’-TGACTATTTCCCGCGACTT-3’序列8(正)：5’-TTGACTATTTCCCGCCACTT-3’序列9(正)：5’-ATCTATTTCGCGCCCTTATG-3’序列10(正)：5’-TTAAGTTTCGCGCCCTTTCTC-3’其中，正即仅列出正义链，反义链略；修饰类型中，一类为部位位点硫代化修饰，下划线处为修饰位点，另一类为两端各3个核苷酸硫代化修饰或全硫代修饰，R＝G/A；H＝A/C/T；Y＝C/T；S＝C/G；W＝A/T。下面通过具体的实施例说明上述寡聚核酸对肿瘤的抑制作用。实施例1寡聚核酸体外对肿瘤细胞生长的抑制作用。合成的序列1～序列10及其反义链的寡聚核酸，同时经过不同的结构修饰，包括三种，特定位点的硫代(如上所述)、两端3个碱基硫代和全硫代三组，经HPLC纯化，纯度90％以上，灭菌水配制成浓度1mg/mL后，正反义链等摩尔数混合、水浴加温至85℃10分钟，自然冷却至室温，退火结合成双链备用。体外按常规方法分别培养乳腺癌细胞株MDA-MB-231、肺癌细胞株NCI-H1975、胰腺癌细胞株CFPAC-1，待细胞生长到105-106个/mL时，细胞消化收集、计数、配制成浓度为3～5×104个/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔3～5×103个细胞)；将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释各组寡聚核酸至所需浓度，每孔加入100μL相应的含寡聚核酸的培养基，同时设立阴性对照组和阳性对照组，其中，阴性对照组为生理盐水，阳性对照组为紫杉醇，转染方法参照Lipofectimine的产品说明书；96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时；每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸，其特征在于，所述寡聚核酸为下述序列1～10中的任意一种：序列1：5`‑CTTGAGGGGAATTTCCCAG‑3`序列2：5`‑GAGAGGGGACTTTCCGAGAG‑3’序列3：5`‑CCTTGAAGGGATTTCCCTCC‑3`序列4：5’‑GCCATTTCCGGGAATTGCTA‑3’序列5：5’‑AGTTCTGGGAATTCC‑3’序列6：5’‑AGTCATTTCCGGGAAATGACT‑3’序列7：5’‑TGACTATTTCCCGCGACTT‑3’序列8：5’‑TTGACTATTTCCCGCCACTT‑3’序列9：5’‑ATCTATTTCGCGCCCTTATG‑3’序列10：5’‑TTAAGTTTCGCGCCCTTTCTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸，其特征在于，所述寡
聚核酸为下述序列1～10中的任意一种：
序列1：5`-CTTGAGGGGAATTTCCCAG-3`
序列2：5`-GAGAGGGGACTTTCCGAGAG-3’
序列3：5`-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3`
序列4：5’-GCCATTTCCGGGAATTGCTA-3’
序列5：5’-AGTTCTGGGAATTCC-3’
序列6：5’-AGTCATTTCCGGGAAATGACT-3’
序列7：5’-TGACTATTTCCCGCGACTT-3’
序列8：5’-TTGACTATTTCCCGCCACTT-3’
序列9：5’-ATCTATTTCGCGCCCTTATG-3’
序列10：5’-TTAAGTTTCGCGCCCTTTCTC-3’。
2.根据权利要求1所述的寡聚核酸，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪根，叶青，孙益军，
申请(专利权)人：南京艾德凯腾生物医药有限责任公司，南京凯基生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32