一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用。一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术以Kefir粒为对象，通过设计通用引物组，分别克隆出不同乳糖酶基因，插入到原核表达载体中，构建了该基因在大肠杆菌中过量表达的工程菌库，为进一步筛选能够适应不同条件的乳糖酶，或者制取乳糖酶复合制剂奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用，属于基因工程

技术介绍
乳糖酶(lactase)，即β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，该酶可催化两种类型的反应：一是水解作用，即将一分子的乳糖水解为一分子的葡萄糖和半乳糖；二是半乳糖苷的转移作用，即能把半乳糖残基转移到乳糖、葡萄糖等糖基上。乳糖酶在以乳制品加工为主的工业中运用广泛，主要体现在以下方面：I、水解乳制品中的乳糖，生产低乳糖的乳制品用以供给乳糖不耐受人群食用。对大部分正常人来说，乳糖是不能直接被机体利用的，只有经乳糖酶水解，变成为半乳糖与葡萄糖后才能被人体利用；如果人体由于种种原因缺乏乳糖酶时则会造成乳糖未被吸收，就会引起腹鸣、腹胀、腹痛等症状，这种情况称为乳糖不耐受(Lactasenon—persistent，LNP)。由于遗传、饮食习惯等因素的影响，亚洲人中乳糖不耐症患者较多，我国成年人中大概有90％以上的人会出现乳糖酶活性下降的情况，这其中有15％左右的乳糖不耐受人群，他们不能像其他人一样从牛奶等乳制品中获得丰富的营养，因此只有开发添加β-半乳糖苷酶后的低乳糖的乳制品方能满足他们的需要。II、减少乳糖结晶析出在冷饮等食品工业中，通过添加乳糖酶，可使原来溶解度较低的乳糖转变为溶解度更大、甜度更高的单糖，这样能减少在乳类和冰淇淋中浓缩的乳糖结晶析出，同时也能够增加食品的甜度。III、降低废物的排放，促进乳清等副产品的综合利用在干奶酪加工等生产中过程中要产生大量的副产品——乳清。如果不经任何处理而当废水排放，这样不仅会污染环境，而且还要造成极大浪费。其实可以根据乳清中富含乳糖等营养物质的特点，利用乳糖酶将其水解为乳清糖浆，可使其中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，这样就会增加糖浆甜度和溶解度，可部分代替蔗糖，用于面包、饮料等食品加工工业中。此外，利用乳糖酶的半乳糖苷的转移作用生产的低聚半乳糖已经开始投放市场，低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)不被人体吸收，但能被肠道内双歧杆菌所利用，是很好的益生元。乳糖酶的分布非常广泛，在许多植物、动物以及微生物中都有乳糖酶的存在。尤其是在真菌和细菌等微生物中分布更加广泛，目前已经从多种微生物中发现乳糖酶，比如：细菌中有芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌有天蓝色链球菌；霉菌有黑曲霉、米曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸酵母等。β-半乳糖苷酶的编码基因为β-半乳糖苷酶基因，由于其来源不同，不同种属生物的β-半乳糖苷酶基因存着较大的差异性，所编码的乳糖酶的最适温度，pH值等酶学性质也各不相同。国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMA)，根据氨基酸序列一致性比较，将已发现的各种糖基水解酶分成了133个家族，分别命名为GH1——GH133家族。在目前发现的133个家族中，β-半乳糖苷酶存在主要存在于第GH2，GH42家族，而且多数来自于乳酸菌等原核生物，在同一家族中的乳糖酶基因其相似性比较高。乳糖酶的工业生产方法主要是微生物发酵法，根据其发酵菌株的不同，制取得到的乳糖酶酶学性质也各不相同。为了获得产酶量高的菌株，除了常规的微生物诱导筛选方法外，目前常采取利用基因工程等技术手段，将乳糖酶基因克隆并转化到其他生物细胞中进行过量表达的方法来构建乳糖酶高产的工程菌株。Kefir粒(开菲尔粒)是一种原产于高加索地区的用于生产开菲尔发酵乳的发酵剂，它是一种由不同的微生物所构成的一个凝胶状微生物群落。Kefir粒中的微生物间存在着一种复杂共生关系，组成Kefir粒的微生物菌相非常复杂，其中乳酸菌含量最多，约占整个菌群总数的90％以上，而且其构成也非常复杂，已经发现的乳酸菌有：乳杆菌类的马奶酒样乳杆菌Lactobacilluskefiranofaciens，嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，短小乳杆菌Lactobacillusbrevis，植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，干酪乳杆菌Lactobacilluscasei，瑞士乳杆菌Lactobacillushelveticus，发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus，以及小鼠乳杆菌Lactobacillusmurinus，戊糖乳杆菌Lactobacilluspentosus，Japonicus葡糖杆菌Gluconobacterjaponicus，双歧杆菌Bifidobacterium等；乳球菌类乳酸乳球菌Lactococcuslactis，嗜热链球菌Streptococcusthermophiles，肠膜明串珠菌Leuconostocmesentroides等。Kefir粒存在于牛乳、羊乳等富含乳糖的环境中，需要依靠其丰富乳酸菌群产生大量不同种类的乳糖酶，将乳糖水解成单糖后作为碳源利用。因此Kefir粒也是一个天然的乳糖酶资源库。乳酸菌是一类革兰氏阳性、利用可发酵糖产生大量乳酸的微生物的通称。乳酸菌广泛地存在于自然界、动物体内、乳制品和发酵食品中，且大多数为非致病菌，通常被认为是安全的GRAS级(GenerallyRecognizedAsSafe)的微生物，在医药、食品及饲料等工业中获得了日益广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用。本专利技术技术方案如下：一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，所述特异引物组包含两对特异引物，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。GH2家族特异引物核苷酸序列如下(I为次黄嘌呤)：GH2-up:GGATCCATGIAAGCAAAIATIAAATGG——BamHISEQIDNO.1GH2-down:CTCGAGTTAAAAITIGTTIAIIATGAAIGA——XhoISEQIDNO.2GH42家族特异引物核苷酸序列如下：GH42-up:GGATCCATGACAIAAACITTAICACGI——BamHISEQIDNO.3GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAAIACTTGIAC——XhoISEQIDNO.4一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法，包括如下步骤：(1)将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在20～30℃的条件下培养60～84h，然后离心，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，然后用浓度为45～55mmol/L、pH7.5～8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行第二次重悬，离心取沉淀，然后用含有浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和18～22mmol/LEDTA、pH7.5～8.5的混合溶液进行第三次菌体重悬，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA；(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别用上述GH2家族特异引物和GH42家族特异引物进行PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，其特征在于，所述特异引物组包含两对特异引物，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，其特征在于，所述特异引物组包含两对特异引物，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。2.一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在20～30℃的条件下培养60～84h，然后离心，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，然后用浓度为45～55mmol/L、pH7.5～8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行第二次重悬，离心取沉淀，然后用含有浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和18～22mmol/LEDTA、pH7.5～8.5的混合溶液进行第三次菌体重悬，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA；(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别用权利要求1所述的GH2家族特异引物和GH42家族特异引物进行PCR扩增，制得扩增产物lacgh2和lacgh42；(3)将步骤(2)制得的扩增产物lacgh2和lacgh42经BamHI和XholI双酶切后，与同样经BamHI和XholI双酶切的质粒表达载体pET30a连接，制得重组表达载体，然后转化至大肠杆菌中，筛选转化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌资源库。3.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取DNA的步骤如下：向菌悬液中按0.8～1.2mg/mL的比例加入溶菌酶，按0.08～0.12mg/mL的比例...

【专利技术属性】
技术研发人员：何熹，赵新节，韩宁，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37