用于加工DNA底物的改进方法技术

本发明专利技术描述了将衔接体连接至片段化的双链DNA分子的端部的方法。这种新方法克服了向DNA片段的5’端添加磷酸基团的需要。相反，5’末端碱基由于DNA的物理片段化而被破坏。通过去除破坏的碱基，具有5’磷酸的连接相容性碱基暴露并且衔接体连接效率恢复，导致从减少的输入DNA量构建文库的能力和文库产量显著增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年1月31日提交的美国临时专利申请号61/934,515和2014年11月11日提交的美国临时专利申请号62/078,309的优先权，所述申请的公开文本各自通过引用其全文纳入本文。电子提交材料通过引用纳入本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名：47999A_Seqlisting.txt；建立时间2015年1月29日；47,035字节)，其作为公开内容的独立部分，并且通过引用其全文纳入本文。引言所有市售的新一代测序(NGS)技术均需要文库制备，由此，使特定的衔接体序列(adaptersequence)对连接至DNA片段的端部，以允许通过仪器进行测序。大多数NGS衔接体包含三个功能结构域：(1)用于文库和克隆扩增的独特PCR引物退火序列，(2)独特测序引物退火序列，和(3)独特样品索引序列。目前，大多数平台采用克隆扩增，以产生各个体DNA文库分子的数百种拷贝。这通过桥式扩增或乳液PCR来实现，其目的是扩增产生的信号，以用于针对各文库分子的具体序列检测模式(例如，荧光或pH)。对于通过合成的测序，测序引物的退火域并置于衔接体插入物接合处；为了允许配对末端测序，各衔接体具有用于引物退火的独特序列。样品索引序列(indexsequence)包含短独特序列，通常在6-8个碱基，从而在经测序时，鉴定具体序列读数的样品来源，以允许多重测序或共同测序样品。现有并不断涌现单一分子测序技术，其不依赖于用于信号检测的克隆扩增，但仍需要将衔接体序列连接至其末端以用于其它目的，例如，向DNA双链体添加末端发夹环以允许对作为单一分子的两条链进行测序，或引入前导序列以用于纳米孔进入。靶向的新一代测序由如下两种领导性技术涵盖：扩增子测序和全基因组文库的靶标杂交-捕获富集。扩增子测序是为了快速周转时间而选择的方法，因为减少了步骤的数量，其用于所需的目标基因座的组的数量显著小于全外显子组时，并且用于大量节省制备性试剂和测序深度方面的总体成本。扩增子测序由多种可用技术代表。这些的示例包括1.多重PCR，其采用可降解的靶标特异性引物以消除引物二聚体，随后进行精加工和NGS衔接体连接，其中，重叠的靶标被分入分开的管中(离子激流AmpliSeq)；2.多重延伸-连接反应，其将NGS衔接体引至各靶标特异性寡核苷酸对的末端处，随后进行NGS衔接体介导的PCR扩增，总之这避免了多重PCR；然而，连接介导的PCR需要较高的输入DNA的量(IlluminaTSCA)；3.微流体室上进行的多重PCR，其将引物对分开，以避免形成引物二聚体，并且允许重叠的目标基因座；分开的反应需要较高的输入DNA的量(Fluidigm访问阵列)；4.通过数字微滴式PCR进行的多重PCR，其也将引物对分开以避免形成引物二聚体，并允许重叠的目标基因座；同样地，其需要较高的输入DNA的量(Raindance)。各技术经设计以消除引物二聚体或避免其在多重扩增过程中形成，为了避免所得的NGS扩增子文库被这些矫作物主导。现有方法的缺点是：A.微流体或数字微滴式仪器与耗材的高成本，B.较高的输入量需求；和C.必须分开多重反应，其中需要重叠或连续的覆盖范围，因此进一步增加了输入量需求。当需要连续覆盖时，这些选项的替代方式是进行长片段PCR。然而，长片段PCR难以多重化，并且分开NGS文库制备之后的大多数测序平台所需的后续片段化既耗时间又费成本。本领域需要扩增子生成的简单方法，其允许约10纳克(ng)DNA的低输入，不需要除热循环仪以外的仪器，并且，当需要连续覆盖时，无关于靶标是不是分开的热点基因座，或者靶标是不是基因组的重叠区域。本文所述的组合物和方法提供了满足该需求的方案。通常，NGSDNA文库的制备涉及5个步骤：(1)DNA片段化、(2)精加工、(3)衔接体连接、(4)尺寸选择，和(5)文库扩增(参见图1和2)。(1)片段化：DNA片段化可通过酶促消化或物理方法，例如声处理、雾化或水动力剪切来进行。各片段化方法具有其优势和限制。酶促消化产生DNA端部，其可被高效地精加工并连接至衔接体序列。然而，难以控制酶促反应并产生具有可预测长度的片段。此外，酶促片段化常常是碱基特异性的，因此向序列分析中引入表示偏差(representationbias)。使DNA片段化的物理方法更加随机，并且DNA大小分布可能更易被控制，但由物理片段化产生的DNA端部是被破坏的，并且常规精加工反应不足以产生充分连接相容性端部。(2)精加工：典型的精加工混合物包含T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶(PNK)。T4DNA聚合酶的5'-3'聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性切下3’突出，并填充3’凹陷的端部，这导致切除破坏的3’碱基并且精加工(产生钝端)DNA端部。精加工混合物中的T4多核苷酸激酶将磷酸添加至DNA片段的5’端，其可能对此有所缺乏，因而使其与NGS衔接体连接-相容。本领域依然未知的是，由物理片段化产生的大量5’端以不明方式被破坏，并且不被PNK磷酸化。常规精加工混合物中没有能够修剪被破坏的5'末端碱基的酶。由此，制备中的大量DNA片段部分没有被转化成NGS文库分子，因为它们的5'末端处仍保持与NGS衔接体连接不相容。尽管本领域已知，衔接体连接是无效的，但连接通常在两条链上同时进行，从而仍然未知哪一条链是受限的。我们将反应分成链特异性连接，以分别测试其各自的效率。通过该分析，我们能够查明对于5'末端的总体过程中的速率限制步骤，其对于大量DNA片段部分，对于PNK以及衔接体连接而言是较差的底物。(3)衔接体连接：除缺乏5’磷酸基团之外，促成低NGS文库产率的另一个因素是连接反应本身。在连接之前，通常进行的是采用缺乏3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶对于修复的DNA进行的腺苷酰化，以使嵌合体形成以及衔接体-衔接体(二聚体)连接产物最小化。在这些方法中，单一3’A-突出DNA片段被连接至单一5’T-突出衔接体，而A-突出片段和T-突出衔接体具有对于自身连接而言不相容的粘性端部。然而，腺苷酰化反应不完整的，并且产生非特异性副产物，这进一步减少了可用于连接的分子的数量，从而降低了文库生成。本文中提供了更高效的替代性方法，以使多联体形成最小化。(4)尺寸选择：尺寸选择过程也影响文库生成。在尺寸选择过程中，通过基于凝胶或珠的选择方式将具有不需要的尺寸的片段从文库消除，以使文库插入物大小(insertsize)对于所需的测序读取长度最优化。这通过使从短DNA文库插入物发生的成对末端测序的重叠最小化而使序列数据输出最大化。在样品具有极其有限的输入量的情况中，可跳过该步骤，并且，为了换取更高程度的成对端部重叠，对更多的稀有片段测序。(5)扩增：低文库产量的问题导致必须在NGS分析之前通过PCR扩增文库，这导致文库复杂性的丧失和碱基组成偏差的引入。目前用以避免该问题的唯一方案是采用较高量的输入DNA用于文库制备，但提交用于NGS分析的高达20％的临床样品的DNA量不足，于是要替代性地进行额外的PCR循环来克服DNA输入的不足。这导致因存在不可接受的PCR重复百分比而造成减少的序列数据。
技术实现思路
为了解决上文所述的造成NGS文库构建的低产量的现本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含：连接酶和第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是至少部分双链的且包含寡核苷酸1和寡核苷酸2；其中，寡核苷酸1包含5’磷酸和位于其3’末端的封闭基团；并且其中，寡核苷酸2(i)包含易于降解的碱基，和/或(ii)可通过非变性热条件被置换，并且还包含位于其3’末端的封闭基团，所述封闭基团阻止寡核苷酸1的3’端的连接但允许5’端的连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.31 US 61/934,515;2014.11.11 US 62/078,309;1.一种组合物，其包含：连接酶和第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是至少部分双链的且包含寡核苷酸1和寡核苷酸2；其中，寡核苷酸1包含5’磷酸和位于其3’末端的封闭基团；并且其中，寡核苷酸2(i)包含易于降解的碱基，和/或(ii)可通过非变性热条件被置换，并且还包含位于其3’末端的封闭基团，所述封闭基团阻止寡核苷酸1的3’端的连接但允许5’端的连接。2.如权利要求1所述的组合物，其中，寡核苷酸2的3'封闭基团是3’脱氧胸腺嘧啶、3'脱氧腺嘌呤、3'脱氧鸟嘌呤、3'脱氧胞嘧啶或双脱氧核苷酸。3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中，所述易于降解的碱基是脱氧尿嘧啶、核糖核苷酸、脱氧次黄苷，或肌苷。4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述非变性热条件是约50℃至约85℃。5.如权利要求1所述的组合物，其中，寡核苷酸2包含使寡核苷酸2的结合稳定性降低的碱基修饰，其中，所述碱基修饰是脱氧次黄苷、肌苷或通用碱基。6.一种组合物，其包含：由双链底物与如权利要求1所述的组合物孵育所得的连接产物；连接酶，具有缺口平移活性的DNA聚合酶，识别易于降解的碱基的核酸内切酶，和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸是单链的，并且包含3’域，其与多核苷酸2的寡核苷酸1的5’部分足够互补以在多核苷酸1的寡核苷酸2被降解或置换时，在合适的条件下退火。7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述第二多核苷酸具有足够的长度以置换第一多核苷酸的寡核苷酸2，或所述第二多核苷酸包含使其结合稳定性增加的碱基修饰。8.如权利要求6所述的组合物，其中，所述核酸内切酶选自下组：UDG加核酸内切酶VIII、RNA酶HI、RNA酶H2和核酸内切酶V。9.如权利要求6所述的组合物，其中，所述连接酶是大肠杆菌DNA连接酶或T4DNA连接酶。10.如权利要求7所述的组合物，其中，使其结合稳定性增加的碱基修饰是锁核酸(LNA)。11.一种组合物，其包含：由双链底物与如权利要求1所述的组合物孵育所得的连接产物；连接酶；侧翼核酸内切酶；识别易于降解的碱基的核酸内切酶；第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含含有3’域的单链的寡核苷酸，其与多核苷酸2的寡核苷酸1的5’部分足够互补以在多核苷酸1的寡核苷酸2被降解或置换时，在合适的条件下退火。其中，所述第二多核苷酸具有足够的长度以置换第一多核苷酸的寡核苷酸2，或所述第二多核苷酸包含使其结合稳定性增加的碱基修饰，并且其中，所述第二多核苷酸还包含3’末端简并碱基。12.一种产生经加工的底物分子的方法，所述方法包括：(i)连接第一多核苷酸至底物分子的3’末端，所述底物分子是至少部分双链的；(ii)在促进退火的条件下，使第二多核苷酸退火至第一多核苷酸；(iii)从所述底物分子的5’末端切下至少一个核苷酸；和，然后(iv)将所述第二多核苷酸连接至所述双链的底物分子的5'末端，以产生所述经加工的底物分子。13.如权利要求12所述的方法，其还包括如下步骤：在步骤(i)之前，使所述底物分子与磷酸酶接触。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述磷酸酶是牛小肠磷酸酶或虾磷酸酶。15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其还包括如下步骤：通过使所述底物分子与具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶接触来使所述底物分子具有钝端。16.如权利要求15所述的方法，其中，所述聚合酶选自下组：T4DNA连接酶、Klenow片段、T7聚合酶，及其组合。17.如权利要求15所述的方法，其还包括如下步骤：使所述底物分子与模板非依赖性聚合酶接触，以使所述底物分子的3’端腺苷酸化。18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中，所述底物分子是天然产生的，或所述底物分子是合成的。19.如权利要求18所述的方法，其中，所述底物分子是天然产生的。20.如权利要求19所述的方法，其中，所述底物分子是基因组DNA。21.如权利要求20所述的方法，其中，所述基因组DNA是真核的或原核的。22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其中，所述基因组DNA体内或体外片段化的。23.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其中，所述底物分子是循环无细胞DNA。24.如权利要求23所述的方法，其还包括：在步骤(i)之前，调节温度至约50℃～约85℃。25.如权利要求24所述的方法，其中，所述温度是65℃。26.如权利要求22所述的方法，其中，所述体外片段化通过选自下组的方法进行：剪切、用核酸内切酶切割、声处理、加热、采用α、β或γ源的辐照、在金属离子存在下进行化学切割、自由基切割，及其组合。27.如权利要求22所述的方法，其中，所述体内片段化通过选自下组的方法发生：凋亡、辐照，和石棉接触。28.如权利要求18所述的方法，其中，所述底物分子是合成的，并且选自下组：cDNA、通过全基因组扩增产生的DNA、包含至少一个双链末端的引物延伸产物，和PCR扩增子。29.如权利要求12-28中任一项所述的方法，其中，所述第一多核苷酸是至少部分双链的，且包含寡核苷酸1和寡核苷酸2。30.如权利要求29所述的方法，其中，所述第二多核苷酸退火至寡核苷酸1。31.如权利要求30所述的方法，其中，所述退火导致第二多核苷酸和所述底物分子之间的缺口、间隙，或重叠碱基。32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中，使所述第二多核苷酸与聚合酶接触，导致寡核苷酸2的降解。33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中，寡核苷酸2包含易于降解的碱基。34.如权利要求33所述的方法，其中，所述易于降解的碱基选自下组：脱氧尿嘧啶、RNA、脱氧次黄苷，和肌苷。35.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其中，寡核苷酸2包含位于其3’末端的封闭基团，所述封闭基团防止连接。36.如权利要求35所述的方法，其中，所述封闭基团是3’脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸。37.如权利要求12-36中任一项所述的方法，其中，所述第二多核苷酸包含修饰的碱基。38.如权利要求30所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·马卡洛夫，J·拉利伯特，
申请(专利权)人：斯威夫特生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US