一种毛细管等电聚焦测定重组蛋白质等电点的改进方法技术

本发明专利技术提供了一种毛细管等电聚焦(cIEF)测定重组蛋白质等电点的方法，它包括以下步骤：1)取重组蛋白，经浓缩脱盐，得到浓缩蛋白溶液；2)将载体两性电解质、凝胶、助溶剂、占位剂、等电点标记物与步骤1)的浓缩蛋白溶液进行混合，制备为供cIEF分析的样品混合液；3)用不同溶液对毛细管进行活化；4)将步骤2)中的样品混合液上样于毛细管中，20℃下进行聚焦分离，采用迁移溶液迁移，紫外吸收检测器记录cIEF图谱。5)根据步骤4)中的cIEF图谱，确定待分析样品混合物中重组蛋白各异构体的等电点。本发明专利技术所使用的方法具有分离效果好、峰容量高、重复性好、重现性强等优点，且适用于酸性重组蛋白质的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种毛细管等电聚焦测定重组蛋白质等电点的改进方法
本专利技术属于生物制品分离分析领域，具体涉及一种毛细管等电聚焦测定酸性重组蛋白质等电点的方法。
技术介绍
近年来，随着DNA重组技术的飞速发展，重组蛋白类药物用于治疗各种疾病已成为生物医药行业研发的热点之一。目前，大多数重组蛋白都属于糖蛋白，重组蛋白类药物的糖基化和糖结构与体内稳定性和生物学活性密切相关。在生产过程中，宿主动物细胞、培养基组成、培养条件、培养环境和蛋白质结构以及分离纯化工艺都会影响重组蛋白质的糖基化水平。糖蛋白类生物技术药物因糖基化的差异产生多种异构体，每种异构体会对重组蛋白的理化性质和药理起到不同的作用，主要体现在蛋白质的电荷状态、稳定性、溶解性、免疫原性、体内外生物学活性、药物动力学等方面。为了保证重组蛋白类药物治疗效果的稳定性，须将不同生产批次蛋白质产品糖基化水平的异质性控制在合理的范围内，确保各种异构体的含量达到一定的标准，从而保证糖蛋白类生物技术药物质量和产品的均一性。由于重组蛋白异构体的分子量、分子结构非常接近，常用的分析方法如平板凝胶等电聚焦方法无法有效区分这些异构体，因而不适用于分析重组蛋白各种异构体组成和含量。然而，等电点(pI)是重组蛋白异构体固有的性质之一，不同的异构体由于糖型组成和结构的不同，等电点通常也有差异，因而可以利用不同异构体等电点的差异对其进行分离和定量分析。对重组蛋白质等电点准确掌握的程度，直接关系到最终生产药物的质量。所以，准确测定蛋白质等电点是保证产品质量、完善生产工艺的重要因素。人促卵泡激素(humanfolliclestimulatinghormone，hFSH)是一种异二聚体糖蛋白激素，由α亚基和β亚基通过非共价键结合而成，其中，α亚基和β亚基各含两个N-连接糖基化位点。唾液酸通常在hFSH糖基化侧链的末端，随着唾液酸含量升高，pI值降低，生物活性升高。对于长效hFSH药物来说，即将羧基末端肽(carboxylterminalpeptide，CTP)序列融合到hFSH的β亚基的C末端形成hFSH-CTP融合蛋白，引入了CTP的4个O-连接糖基化位点，从而提高了hFSH的生物学活性和半衰期。现有技术吉林大学硕士论文—重组人促卵泡激素的纯化及鉴定_刘慧娟(2007年)公开了采用IEF等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)检测重组人促卵泡激素等电点的方法，IEF检测rhFSH等电点时，各等电点异构体的分离效果较差，rhFSH酸碱端条带不清晰，且主要根据等电点标记物来进行测算各异构体的pI值，因此pI值检测结果不够准确。毛细管等电聚焦(Capillaryisoelectricfocusing，cIEF)是基于等电点差异进行蛋白质分离的高分辨率分离技术，它通过将带有两性基团的样品、载体两性电解质和添加剂的混合物注入毛细管内，在电场下形成一定范围的pH梯度，样品组分依据其所带电性向阴极或阳极迁移，当柱内pH值与该组分的pI相同时，该组分的净电荷为零，溶质分子便实现聚焦，形成明显的区带，使蛋白质样品中各组分得到分离。cIEF克服了平板等电聚焦方法操作复杂、无法实现自动化和无法准确测定电荷异构体含量及等电点等缺点，具有高效、快速、操作简单、分离精度高(可达到0.01个pH单位)和定量分析能力强等优点，因而广泛应用于检测重组蛋白产品电荷异质性。尽管cIEF已广泛应用于重组蛋白类药物的质量分析，但是在分离分析重组蛋白质样品时，常以阳极为毛细管电泳仪检测样品的入口端、阴极为出口端(如AlejandroCifuentes等，JournalofChromatographyA,830(1999)453–463；ScottMack等，Electrophoresis2009,30,4049–4058等)，使得样品电荷异构体出峰顺序为先碱性后酸性，所以对于酸性样品其分离峰通常在检测图谱的末端，分离效果差，特别是对于pI<4.1的电荷异构体以及等电点标记物，即使延长了分离时间，也不能使样品出峰，导致检测结果不准确。此外，检测样品离子强度、毛细管涂层材料、pH梯度稳定性以及聚焦分离条件等诸多因素，常影响酸性重组蛋白质各电荷异构体的分离效果、峰容量和cIEF检测方法的重复性及重现性等。因此，亟需专利技术一种可准确检测酸性重组蛋白质电荷异质性的cIEF方法。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的技术缺陷，本专利技术提供了一种毛细管等电聚焦测定重组蛋白质等电点的方法，使用阴极为毛细管电泳仪检测样品的入口端、阳极为出口端，并用氨水作为化学迁移液，以保证酸性重组蛋白质电荷异构体的出峰顺序为先酸性后碱性，使得各分离峰可以较好的位于等电点标记物标示范围以内，并具有较好的分离效果。另一方面，本专利技术提供了不同占比的Pharmalyte(2.5-5)和Pharmalyte(3-10)载体两性电解质的混合物，浓缩脱盐后待检样品中添加适量的尿素，和优化的聚焦分离条件，可有效提高酸性重组蛋白质各电荷异构体的分离效果。该方法具有分离效果好、峰容量高、重复性好、重现性强等优点，且尤其适用于酸性重组蛋白质的质量控制。本专利技术提供的一种毛细管等电聚焦测定重组蛋白质等电点的方法，包括以下步骤：1)取重组蛋白溶液，经浓缩脱盐，得到浓缩蛋白溶液；2)将载体两性电解质、凝胶、助溶剂、占位剂、等电点标记物与步骤1)所述的浓缩蛋白溶液进行混合，制备为供cIEF分析的样品混合液；3)用不同溶液对毛细管进行活化；4)将步骤2)中所述的样品混合液上样于步骤3)中已活化的毛细管中，，毛细管电泳仪检测，20℃下进行聚焦分离，采用迁移溶液迁移，紫外吸收检测器记录cIEF图谱。5)根据步骤4)中的cIEF图谱，检测待分析样品混合物中重组蛋白各电荷异构体的等电点。所述步骤1)中重组蛋白优选酸性重组，特别是pH值3-6的重组蛋白，具体优选重组人促卵泡激素(Recombinathumanfolliclestimulatinghormone,rhFSH)；所述的浓缩脱盐采用浓缩柱进行脱盐处理。其中所述的浓缩柱为10kDa超滤离心柱；所述的浓缩蛋白溶液浓度为5-10mg/ml，优选10mg/ml(溶剂为Tris缓冲液)；所述步骤2)中，载体两性电解质包括：Ampholine、Biolyte、Pharmalyte、Servalyt中的一种或多种，优选的所述载体两性电解质是Pharmalyte(3-10)和Pharmalyte(2.5-5)的一种或两种，更优选的，Pharmalyte(2.5-5)的体积比为0～90％，Pharmalyte(3-10)的体积比例为10％～100％。进一步优选所述Pharmalyte(3-10)的体积比例为50％～90％，Pharmalyte(2.5-5)的体积比为10～50％，进一步所述的Pharmalyte(3-10)和Pharmalyte(2.5-5)体积比为90％：10％，75％：25％和50％：50％，分离效果最佳。载体两性电解质(CA)是指包含多种既可充当酸又可充当碱的两性组分溶液。载体两性电解质pH梯度的形成及蛋白区带的聚焦受溶液中载体两性电解质物质数目的影响。载体两性电解质数目越多，该毛细管柱内邻近位点之间的pH差异越小，使得pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取重组蛋白，经浓缩脱盐，得到浓缩蛋白溶液；2)将载体两性电解质、凝胶、助溶剂、占位剂、等电点标记物与步骤1)的浓缩蛋白溶液进行混合，制备为供毛细管等电聚焦分析的样品混合液；3)用不同溶液对毛细管进行活化；4)将步骤2)中的样品混合液上样于毛细管中，毛细管电泳仪检测，20℃下进行聚焦分离，采用迁移溶液迁移，紫外吸收检测器记录等电聚焦图谱；毛细管等电聚焦仪检测条件为：以阴极为样品检测的入口端，以阳极为出口端；5)根据步骤4)中的等电聚焦图谱，确定待分析样品混合物中重组蛋白各异构体的等电点。

【技术特征摘要】
1.毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取重组蛋白，经浓缩脱盐，得到浓缩蛋白溶液；2)将载体两性电解质、凝胶、助溶剂、占位剂、等电点标记物与步骤1)的浓缩蛋白溶液进行混合，制备为供毛细管等电聚焦分析的样品混合液；3)用不同溶液对毛细管进行活化；4)将步骤2)中的样品混合液上样于毛细管中，毛细管电泳仪检测，20℃下进行聚焦分离，采用迁移溶液迁移，紫外吸收检测器记录等电聚焦图谱；毛细管等电聚焦仪检测条件为：以阴极为样品检测的入口端，以阳极为出口端；5)根据步骤4)中的等电聚焦图谱，确定待分析样品混合物中重组蛋白各异构体的等电点。2.根据权利要求1所述的毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的重组蛋白包括pH值3-6的重组蛋白，所述的浓缩脱盐采用10kDa超滤离心柱进行脱盐处理，所述的浓缩蛋白浓度为5-10mg/ml。3.根据权利要求2所述的毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，所述的重组蛋白选自重组人促卵泡激素。4.根据权利要求1所述的毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的载体两性电解质是Pharmalyte(3-10)和Pharmalyte(2.5-5)的一种或两种，所述的凝胶是cIEF凝胶，所述的助溶剂是尿素，所述的占位剂是阳极稳定液亚氨基二乙酸，所述的等电点标记物是多肽等电点标记物。5.根据权利要求4所述的毛细管等电聚焦检测重组蛋白质的方法，其特征在于，所述的载体两性电解质是体积比为10-100％Pharmalyte(3-10)和体积比为0-90％Pharmalyte(2.5-5)，所述的助溶剂是3-6M尿素胶，所述的等电点标记物是包含多肽标记物pI3.4、pI4.1和pI5.5。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，罗荣，罗双儒，黎耘，
申请(专利权)人：成都金凯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51