基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种基于磁珠及纳米金探针的高灵敏度微量蛋白质的测定方法，其特征在于：首先用待测蛋白的单克隆抗体标记磁珠，在纳米金上标记待测蛋白的多克隆抗体，在纳米金上同时还标记一种带有生物素标记的ＤＮＡ探针，纳米金上的ＤＮＡ探针通过生物素－链亲和素反应，又标记上了辣根过氧化酶（ＨＲＰ），组成纳米金探针，将标记好抗体的磁珠及纳米金探针与待测蛋白样品混合，３７℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针，用ＴＭＢ显色系统进行显色，从而达到对待测蛋白进行定量检测的目的。本发明专利技术检测时间可缩至１－１．５小时，灵敏度达ｐｇ／ｍｌ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的测定，特别是一种基于磁珠及纳米金探针的高 灵敏度微量蛋白质的测定方法，可应用于医学领域。技术背景酶联免疫反应(ELISA)在临床实验室已得到普遍的应用，可用于检测 各种肿瘤标志物、细胞因子、病毒标志物等各种蛋白质，目前也已有多种市 售的ELISA试剂盒。但是，ELISA法操作程序复杂，步骤多，尤其是时间 较长，需要5、 6个小时，给临床应用带来一些不便。如果縮短检测的时间， 则会降低检测的灵敏度，达不到临床所需要的检测要求。因此，为满足临床 快速检测的需要，研发快速、高灵敏度的蛋白质检测方法是近几年的研究热 占。"、、o随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的 成就，为生物医学的发展提供了新的契机。纳米材料具有传统材料所不具备 的特有的三大效应表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。对于小尺 寸的磁珠来说，当外加磁场时，磁珠会被磁化并吸附在磁极上，而撤去外加 磁场时，磁珠的磁性消失，磁珠重新分散在溶液中，而不是聚集在一起。由 于纳米磁珠对外磁场具有良好的响应性，因此可以通过外磁场作用，利用纳 米磁珠进行生物样品的分离和定位等操作，从而实现生物传感器系统的集成 化和自动化。作为标记材料而广泛应用于免疫检测中的纳米胶体金颗粒对生 物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物 医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒标记技术具有 简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只 需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。鉴于以上优点，开发基于磁珠和纳米金粒子的检测技术已成为当今研究的热点，特别适合于广大基层单位、医院、 及大批量时间紧的检测和大面积普査等，因此该技术具有巨大的发展潜力和 应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测 定方法，也即本专利技术要解决的技术问题主要是开发一种微量蛋白质的高灵敏 度的快速测定方法。本专利技术主要内容包括首先用待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠，在纳 米金上标记上待测蛋白质的多克隆抗体，在纳米金上同时还标记一种带有生物素标记的DNA探针，纳米金上的DNA探针通过生物素-链亲和素反应，又 标记上了辣根过氧化酶Horseradish Peroxidase (HRP)，组成纳米金探针，将标记好待测蛋白质单克隆抗体的磁珠及纳米金探针与待测蛋白质样品混合， 3rc孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针，用四甲基联苯胺3，3'5，5-Tetramethylbenzidine (TMB)显色系统进行显色，从而达到对待测蛋白质进行定量测定的目的，具体测定流程见图1。主要包括以下具体内容一、 所用试剂及材料1. 羧基修饰的磁珠购自Dynal公司，直径l-3pm。2. 0.1M磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2)组成为137mmol/LNaCl， 2.7mmol/L KC1， 4.3mmol/LNa2HP04.7H20， 1,4 mmol/L KH2P04。3.0.1M磷酸缓冲液PB (PH7.2) : 0.2MNa2HPO4， 0.2MNaH2PO44. 杂交缓冲液O.IMPBS、 0.5%牛血清白蛋白BSA (质量％)、 0.05%Tween20 (体积％)。5. 洗液O.IMPBS、 0.1%BSA (质量％)、 0.05%Tween20 (体积％)。6. TMB显色液，购自上海科华生物有限公司。二、 具体的实施方式1待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠1.1活化磁珠选用羧基修饰的磁珠，用300 25mMsfonic acid (MES)溶液(pH6)清洗300-500|il磁 珠(相当于3-5mg磁珠)两次，加冰浴的50mg/ml碳二亚胺 (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDC) 溶液40-60|il、 50mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide NHS)溶 液40-60W， 室温孵育30min;再用300W 25mM MES溶液(pH6)洗两次。 1.2标记磁珠用60-100ial25mMMES溶液(pH6)溶解150-250吗的待 测蛋白质的单克隆抗体，充分混匀，加入到已活化的抗体里，再加40^1 25mM MES (pH6)，使终体积为100-14(Hil;室温放置半小时或4。C放置2小时； 再用300-500pl PBS (含0. 1-0. 5%BSA及0. 01-0. l%Tween-20)洗4次，按 所需浓度重悬磁珠，2-8。C储存备用。2多克隆抗体及DNA探针标记纳米金2.1 确定抗体的最佳用量取lOOpl不同浓度的抗体(浓度分别为 0ug/ml、 0. 5fig/ml、 lpg/ml、 2ng/ml、 3jig/ml、 5ng/ml)加到lml纳米金 溶液里，室温静置5分钟，再向上述各管中加入100^x1的lNNaCl溶液，室 温静置1小时，稳定lml纳米金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标 记蛋白质的最佳用量。2.2 抗体标记按照前面确定的抗体用量标记lml纳米金，室温放置30分钟-1小时。2. 3 DNA探针标记向经过抗体标记的纳米金溶液里，加入巯基(5， 端)及生物素标记(3，端)的DNA探针，使DNA探针的终浓度为3-5uM，室 温静置标记17小时，加入稳定剂(终浓度为含0. 5-腦A、 0. 1NNaCl、 lOraM 的PB溶液)稳定48-72小时，离心清洗3-4次，洗去未标记上的抗体及DNA 探针。2.4 HRP标记将2-3pl链亲和素-HRP (浓度为lmg/ml)与标记了 抗体及DNA探针的纳米金溶液混合，在室温下放置1小时，用PH7.2的0.1M 磷酸盐缓冲液PBS清洗3-4次，洗去未标记上的链亲和素-HRP，再加100^1 10mMPB (含1。/。BSA)重悬，4。C保存备用。 3免疫反应取标记好抗体的磁珠0. 5-l|ul，先与待测样品10-2(^1在37。C下孵育30 分钟-l小时，引入磁场，用洗液(含0.05。/oTween20及0.线BSA的PBS)清 洗3-4次，再加入1-2pl标记好的纳米金探针，继续杂交30分钟，杂交体 积为20pl，杂交液为含0. 05%Tween20及0. 5% BSA组成的0. 1M PBS，形成 磁珠-待测蛋白-纳米金探针复合体，引入磁场，清洗4次，洗去未反应的纳 米金探针。4 显色反应向上述形成的磁珠-待测DNA-纳米金探针复合体中加入20-30pl HRP酶 底物-TMB显色液，避光孵育10-15分钟，加入终止液(O. 2M浓硫酸)10-15|il， 90分钟内，450nm测0D值。 本技术的优点及特点本技术最大的特点及优点是灵敏度高，检测方便，耗时短。 1灵敏度高本技术主要采用基于纳米颗粒的、利用信号探针放大信号及链亲和素-生物素反应放大系统的蛋白质检测技术，在纳米金颗粒上同时标记抗体及起 信号放大作用的信号DNA探针，信号DNA探针同时还标记有生物素分子， 生物素分子通过与链亲和素反应将HRP引入纳米金颗粒上，用来作显色反本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，其特征在于首先用待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠，在纳米金上标记上待测蛋白质的多克隆抗体，在纳米金上同时标记一种带有生物素标记的ＤＮＡ探针，纳米金上的ＤＮＡ探针通过生物素－链亲和素反应，又标记上了辣根过氧化酶，组成纳米金探针；将标记好待测蛋白质单克隆抗体的磁珠及纳米金探针与待测蛋白质样品混合，３７℃温度下孵育，然后再洗去没有反应的纳米金探针，用四甲基联苯胺显色系统进行显色，从而达到对待测蛋白质进行定量测定的目的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾春平，赵建龙，金庆辉，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]