本发明专利技术公开了一种长效重组人脑钠肽融合蛋白(Human Brain Natriumretic-Fc fusion protein，简称hBNP-Fc)及其制备方法，该融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP(hBNP)、肽接头和人IgG4Fc变体。该融合蛋白具有与rhBNP类似或更高的生物学活性，更长的半衰期，更小的副作用。本发明专利技术还涉及重组hBNP-Fc融合蛋白组合物在制备治疗和/或预防急性心衰的药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本专利技术涉及一种长效重组人脑钠 肽融合蛋白及其制备方法与用途。
技术介绍
随着人口老龄化进程的加快及高血压、冠心病等心血管疾病发病率的上升，心力 衰竭的发病率、死亡率也逐年增加。目前欧洲近10亿人口，至少有1500万心衰患者；根据 中国心血管病报告2011指出，我国目前有心衰患者约420万人。人群中心衰的患病率约为 1. 5 %~2. 0 %，随着年龄增加，其发病率也在增加，75岁以前为2-3 %，75-80岁的发病率为 10-20%。在过去的40年中，心衰导致的死亡增加了 6倍，年均心衰死亡率已达到30-50 %。 心衰的预后极差，5年生存率与恶性肿瘤相仿。我国五十家医院住院病例调查报告显示，心 力衰竭住院率占同期心血管病的20% ;死亡率占40%。 心衰的治疗，一方面应该通过强心、利尿、扩血管来改善症状，另一方面应该抑制 神经内分泌系统过度激活、改善心室重构以消除慢性心衰的发病基础。目前治疗心衰的 常用药物主要包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI)/血管紧张素 II受体拮抗剂 (ARB)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂和洋地黄类药物。虽然，这些常规药物对改善心 衰症状起到了良好的作用，但是心衰患者的总体预后仍较差，其产生的副作用主要表现在 药物耐受性、心动过速及其它心律失常、低血压、以及激活与心力衰竭病理过程有关的神经 激素-血管紧张素系统。因此，为了更有效地治疗心衰、逆转心室重构、改善患者的预后、提 高患者生存期，新型药物的研宄也不断地发展。目前已获得指南推荐的治疗新药有伊伐布 雷定、奈西利肽、左西孟旦以及托伐普坦等，为一系列的循证医学提供了依据。 奈西立肽，又称重组人脑利钠肽（rhBNP)，用于治疗急性充血性心衰，属内源性激 素物质，与人心室肌分泌的天然BNP具有相同的32个氨基酸序列（如下式）。 Ser Pro Lys Met Val GlnGlySerGlyCysPheGlyArg Lys Met Asp Arg He SerSer SerSerGlyLeuGlyCys Lys Val LeuArgArg His 奈西立肽氨基酸序列 hBNP与血管平滑肌和内皮细胞上的鸟苷酸环化酶受体结合，引起细胞内第二信 使环单磷酸鸟苷（cGMP)的水平升高，从而引发一系列生理效应：（1)具有内皮非依赖性的 血管舒张活性，扩张动静脉，降低全身血管阻力、充盈压以及肺毛细血管嵌楔压（pulmonary capillarywedge pressure，PCWP)，降低心脏前后负荷；（2)提高肾小球滤过率，产生排钠利 尿作用，降低体液负荷，提高心排血量，综合性改善心脏功能；(3)在体内抑制肾素-血管紧 张素-醛固酮系统（RAAS)的激活，抑制由于扩血管效应引起的反射性心率增加，避免心律 失常的发生；(4)抑制血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的生长，对心肌肥厚有抑制 作用。因此，rhBNP有利于减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状，不同于以前单一的血 管扩张药物或利尿剂，是一个具有多种治疗作用的药物。但是，目前临床应用的rhBNP由于 体内半衰期短（仅为18min)，须频繁给药才能达到治疗目的，影响患者用药的顺应性，进而 影响了产品在临床上的广泛应用。 本专利技术从解决现有rhBNP半衰期短的不足出发，通过将rhBNP与人IgG4Fc片段绞 链区中的半胱氨酸（Cys)残基连接，形成类似IgG4、但缺少CHl区域和轻链的rhBNP-Fc融 合蛋白从而达到延长rhBNP的循环半衰期/增加生物活性，并达到延长药物有效时间、减少 药物副作用等目的。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种长效重组人脑钠肽融合蛋白（Human Brain Natriumretic-Fc fusion protein，重组 hBNP-Fc 融合蛋白，简称 hBNP-Fc)，所述 hBNP-Fc 具有半衰期长、生物活性高等有益效果。 本专利技术的上述有益效果通过以下技术方案实现：一种重组hBNP-Fc融合蛋白，其 特征在于所述的融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP (hBNP)、肽接头 和人IgG4Fc变体。 具体的，所述融合蛋白为二聚化融合蛋白（如图Ib所示），所述的人IgG4Fc变体 为 含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。IgG4Fc变 体CH2区域在228、235 (由EU编号体系确定的位置）含有氨基酸突变，有利于维持IgG4的 空间结构以及降低Fc的效应子功能，并且在纯化融合蛋白时有助于获得均匀完整的制备 物（美国专利 No. 6, 797, 493、6, 900, 292、6, 204, 007)。 所述的肽接头含有2-20个氨基酸，存在于hBNP和人IgG4Fc变体之间，且所述的 肽接头含有两个或更多选自甘氨酸（Gly)和苏氨酸（Thr)的氨基酸。优选的，所述肽接头 的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。 所述的重组hBNP-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4所示。 IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。本专利技术采用的IgG4Fc片段与 hBNP融合，可增强hBNP生物活性，并对hBNP蛋白具有稳定作用，而所得融合蛋白具有较低 的抗体依赖细胞毒性（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxic，ADCC)和补体依赖 细胞毒性（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)活性，副作用较小。 本专利技术的第二个目的在于提供了一种与本专利技术重组hBNP-Fc融合蛋白相匹配的 制备方法，该制备方法包含如下步骤： (1)构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体； (2)构建高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的工程细胞株； (3)批次流加培养工程细胞株，以表达重组hBNP-Fc融合蛋白； (4)重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化。 具体的，所述步骤（1)的具体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hBNP-Fc融 合蛋白基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO. :3所示，包含前导肽序列），插入到哺乳动物细 胞表达载体，获得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒（如图3所示）。 所述的哺乳动物细胞表达载体可采用但不限于市售的如：p⑶NA3. 1(+)、pCMV/ ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选的，所述哺乳动物细 胞表达载体为PCDNA3. 1 (+)。 所述步骤⑵的具体步骤为：将步骤⑴所得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒 转染到合适的哺乳动物宿主细胞，并筛选获得稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株。 所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO、Sp2/0细胞。优 选的，所述哺乳动物宿主细胞为CHO细胞；更优选的，所述哺乳动物宿主细胞为 DHFR(DihydrofolateReductase，二氢叶酸还原酶）缺陷型 CHO 细胞（简称 CHO-DHFIT)。 所述的转染方法选自磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体转染法，优选电穿本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组hBNP‑Fc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP(hBNP)、肽接头和人IgG 4Fc变体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭红卫，赵斌，李小鹏，雒蓬轶，董佳里，罗天学，徐小萍，魏薇，钟绍东，张宝华，
申请(专利权)人：成都金凯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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