融合杀虫蛋白Cry1Am、其编码基因及应用制造技术

本发明专利技术提供一种新型的融合杀虫蛋白Cry1Am及其编码基因，该融合杀虫蛋白对野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆虫具有高杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融合杀虫蛋白可以有效杀死对Cry1Ac蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种融合杀虫蛋白CrylAm、其编码基因 及应用。
技术介绍
虫害是造成农作物严重减产的一个主要因素，防治农业害虫最常见的手段就是使 用广谱化学杀虫剂和一些生物杀虫剂。化学杀虫剂多具有广谱、高毒的特点，在杀死目标 害虫的同时往往将很多益虫一起杀死，严重破坏生态平衡，并对环境造成严重污染；另一方 面，农药残留对人类、牲畜的健康也造成严重威胁。生物杀虫剂具有易降解、与环境高度相 容的特点，但在生产上需要重复施用，大大增加生产成本。为了弥补化学杀虫剂和生物杀虫 剂在农业生产应用中的弊端，科学家们将编码杀虫蛋白的基因导入到植物体内，培育出多 种转基因植物。自1996年至今，已经有多种转Bt基因杀虫作物获得批准进行商业化生产， 但这些抗虫转基因作物多使用CrylA类杀虫蛋白基因，杀虫蛋白基因的单一化、大面积使 用加速害虫抗性的产生，制约了转CrylA类抗虫转基因作物的应用年限。因此，需要不断寻 找具有高杀虫能力、而且能延缓害虫抗性产生的新型基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆虫具有高杀虫能力 的新型融合杀虫蛋白CrylAm及其编码基因。 本专利技术的另一目的是提供所述新型融合杀虫蛋白CrylAm及其编码基因的应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种融合杀虫蛋白CrylAm，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。 本专利技术还提供上述融合杀虫蛋白的编码基因，基因 CrylAm包括编码CrylAb上游 658个氨基酸的核苷酸序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码CrylIa蛋白结 构域III的核苷酸序列、编码CrylIe蛋白结构域I和II的核苷酸序列。 本专利技术还根据玉米密码子的偏好性，对编码上述融合杀虫蛋白的基因 CrylAm进 行改造合成，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。 应当理解的是，由于密码子具有简并性以及不同物种密码子所具有的偏爱性，本 领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。在本专利技术中，所述核苷酸序 列采用了玉米偏爱性密码子。 本专利技术还提供了含有所述基因的表达载体，其中，所述表达载体包括诱导表达载 体和植物表达载体。 本专利技术还提供了含有所述基因的宿主细胞、转基因细胞系和工程菌。 本专利技术还提供了所述基因在提高植物抗虫性中的应用。 进一步地，所述应用是在植物体内表达所述融合杀虫蛋白的编码基因，提高植物 的抗害虫能力。 进一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱等。 进一步地，所述害虫为鳞翅目害虫，包括但不限于亚洲玉米螟、棉铃虫和粘虫等。 本专利技术还提供了所述基因在制备转基因植物中的应用。 本专利技术提供的融合杀虫蛋白CrylAm，对野生型和CrylAb/CryIAc抗性昆虫具有高 杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融 合杀虫蛋白可以有效杀死对CryIAc蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中构建的含有融合杀虫蛋白CrylAm的编码基因的诱导表 达载体pET30a-CrylAm的质粒图谱。 图2为本专利技术实施例4中改造的植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图谱。 图3为本专利技术实施例4中含有融合杀虫蛋白基因的p3301Ubi-CrylAm植物表达载 体图。 图4为本专利技术实施例6中试纸条检测转基因玉米中融合杀虫蛋白CrylAm的表达； 其中，1，非转基因玉米；2-5,转基因玉米。 图5为本专利技术实施例7中转基因玉米温室接虫鉴定结果。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 实施例1融合杀虫蛋白编码基因 CrylAm诱导表达载体的构建 融合杀虫蛋白CrylAm的编码基因，包括编码CrylAb上游658个氨基酸的核苷酸 序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码CrylIa蛋白结构域III的核苷酸序 列、编码CrylIe蛋白结构域I和II的核苷酸序列。所述融合杀虫蛋白CrylAm的氨基酸序 列如Seq ID No. 1所示。根据玉米密码子的偏好性，对编码融合杀虫蛋白CrylAm的基因进 行改造合成，基因 CrylAm的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，基因序列委托上海生工合成 并构建到PUC57载体上，构建得到具有氨苄青霉素抗性的质粒pUC57-CrylAm。 将质粒pUC57_CrylAm及质粒pET30a(购自美国Novagen公司）各取20ng加入 到50 μ L大肠杆菌感受态细胞Trans5 α中，冰浴30min ;42°C热激90sec，冰浴2min ;加入 300 μ L LB液体培养基，37°C低速振荡恢复培养Ihr后，将菌液涂于含相应抗生素的平板 上，晾干；37°C培养箱倒置培养15hr。挑取单克隆菌斑于IOmL含氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C摇床震荡过夜培养，次日，按照天根生化科技（北京）有限公司质粒小提中量 提取试剂盒操作步骤提取质粒，并用NanoDrop 2000C微量紫外分光光度计对提取的质粒 定量。 选择在质粒上有单一酶切位点且恰好位于基因两端的限制性内切酶BamHI和 HindIII双酶切质粒pUC57-CrylAm及pET30a，使基因与载体的两端具有相同的粘性末端。 pUC57-CryIAm酶切后，经琼脂糖胶电泳，对照Marker分别切取约4. 2kb大小的片段，用天根 生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒对核酸片段进行回收；质粒pET30a经双酶切后用 天根生化科技（北京）有限公司纯化试剂盒进行纯化回收。然后，按照T4连接酶的使用说 明将切胶回收的核酸片段与纯化回收的载体片段进行连接，即构建获得含有融合杀虫蛋白 CrylAm的编码基因的诱导表达载体pET30a-CryIAm(图1)。连接反应结束，取5 μ L连接产 物转化大肠杆菌Trans5 α，方法同上。 挑取克隆菌斑于IOmL含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡过夜培养， 次日，提质粒并定量。用BamHI和HindIII双酶切质粒，经琼脂糖电泳验证杀虫蛋白基因与 pET30a酶切位点连接的正确性。 实施例2融合杀虫蛋白CrylAm的诱导与纯化 将测序并酶切验证正确的质粒pET30a-Cry I Am转入购自全式金公司的菌株 Transetta(DE3)中，挑取单克隆，PCR扩增验证阳性菌斑。将检测阳性的菌斑接种于IOmL的 LB液体培养基中（含适宜抗生素），于37°C过夜振荡培养。将含有pET30a-CrylAm质粒的 大肠杆菌菌株Transetta (DE3)，按1:100接种到IOmL LB液体培养基中（含适宜抗生素）， 同样于37°C过夜振荡培养。 次日，按1:200接种到200mL LB液本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合杀虫蛋白Cry1Am，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘允军，王国英，张煜文，刘艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11