使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统技术方案

本发明专利技术涉及通过高效且成本有效的方法纯化核酸。具体地，本发明专利技术通过使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液进行核酸纯化而解决了在多个纯化步骤期间使用不同洗涤和洗脱缓冲溶液造成的费时费力的问题。尤其是在小型化环境中使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液10呈现出获得大量经纯化的核酸的简化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统本专利技术是在国防部高级研究计划局授予的HR0011-12-C-0007下由美国政府支持完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
本专利技术涉及用于使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液来纯化核酸的方法或试剂盒，并且更具体地涉及小型化设置。本专利技术还涉及使用具有低盐浓度和相对高pH的缓冲溶液来纯化核酸。
技术介绍
核酸在许多不同的研究领域中发挥着重要作用。在工业环境中，可以在产品质量管理内部检测核酸，并且在临床环境中，核酸可以用于诊断和/或治疗。在核酸用于许多上述应用之前，需要纯化核酸。核酸纯化通常包括几个步骤，例如暴露含有核酸的样品并将核酸选择性地结合到核酸结合相，对结合的核酸进行纯化并排出杂质，并且获得纯化的核酸。在样品制备、核酸结合、洗涤和洗脱步骤期间通常使用不同的缓冲溶液。最常用的纯化方法通过使用不同的缓冲溶液，基于pH的变化或基于盐浓度的变化来实现核酸的结合/洗涤和随后的洗脱。Qiagen的技术例如基于在核酸结合相上结合并洗涤带负电荷的核酸，当核酸浸入pH<6.5的缓冲溶液时带正电。为了洗脱核酸，使用pH为8.5的缓冲溶液，引起pH增大并且中和核酸结合相的正电荷，由此引起结合的核酸的释放。另一种常用的方法是由Boom等人(EP0389063)开发的，其基于核酸裂解并结合到核酸结合相，例如高浓度的离液盐(例如，硫氰酸胍)中存在硅藻土、玻璃或硅石，其允许带正电荷的离子在带负电荷的核酸与带负电荷的结合相之间形成盐桥。首先将结合的核酸在高盐缓冲溶液存在的条件下进行洗涤，然后用乙醇-水溶液洗涤，并且通过转变为低盐非乙醇缓冲溶液(例如，TE缓冲溶液)进行洗脱。如上所述，当前的核酸纯化方法包括多个洗涤步骤，随后是使用以不同盐浓度和/或不同pH为特征的多种缓冲溶液的洗脱步骤，这使得这些方法耗时且成本高。此外，结合和洗涤缓冲溶液的残留物有时在最终洗脱步骤期间难以除去，并且可能随后干扰下游流程，例如，PCR分析或测序反应。
技术实现思路
因此需要改进的手段和方法来进行简化、快速、低成本且高效的核酸纯化。现有的用于核酸纯化的方法费时费力，因为它们包括多个洗涤步骤，常常使用不同的洗涤缓冲溶液，随后是使用洗脱缓冲溶液洗脱结合的核酸的最终步骤。本专利技术通过提供一种用于纯化核酸的方法解决了这个问题，所述方法包括以下步骤：(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，(iii)使用步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。本专利技术的目的是实现大量对核酸的简化和快速纯化。尤其地，这种大量通常会改善现有的核酸纯化方法，现有的核酸纯化方法通常被设计为以大体积来执行(洗脱体积≥50μl)，这对于某些应用可能是不利的。根据本专利技术，这能够通过采用单一缓冲溶液来洗涤结合到核酸结合相的核酸并随后从核酸结合相洗脱这些核酸的方法来实现。根据本专利技术的方法的优点在于与现有技术中描述的用于洗涤和洗脱样品的不同缓冲溶液相反，仅需要提供一种缓冲溶液来执行该方法。这继而得到与现有技术相反的更简化的方法，并且因此更经济且更具重现性。根据本专利技术，这也能够通过使用单一缓冲溶液来洗涤和洗脱核酸来实现，所述单一缓冲溶液的特征在于≤100mM的相对低的盐浓度和≥7.5的相对高的pH。根据本专利技术的单一缓冲溶液的优点在于可以通过采用非常小的体积的所述缓冲溶液来实现高洗脱效率；此外，通过使用单一缓冲溶液，可以实现对核酸的更快处理，这在小型化环境中是特别有利的。根据本专利技术，对核酸的这种简化且快速的纯化能够通过一种试剂盒来进一步实现，所述试剂盒包括：-核酸结合相，-缓冲溶液，其包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，-用于检测经纯化的核酸的器件。根据本专利技术，对核酸的这种简化且快速的纯化能够通过一种筒来进一步实现，所述筒包括：-包括核酸结合相的第一室，-连接到所述第一室的第二室，所述第二室包括缓冲溶液，所述缓冲溶液包括用于洗涤和洗脱所述核酸的缓冲剂或干燥形式的所述缓冲溶液，-连接到所述第二室的第三室，所述第三室包括含有所述第二室的所述缓冲溶液的缓冲溶液或干燥形式的所述缓冲溶液。与现有技术相比，根据本专利技术的试剂盒和筒是有利的，因为它们其更容易制备并且因此更经济，尤其是对于大规模生产而言是有利的。此外，通过减少试剂盒或筒中包括的不同成分的数量，可变性也明显降低。本专利技术的一个目的是实现通过使用本专利技术的缓冲溶液从核酸结合相进行核酸洗涤和洗脱，这将允许在洗脱之后直接且即时地进一步处理经纯化的核酸，例如在扩增或测序反应中。用于核酸纯化的现有方法难以按比例缩小到在诸如微流体设备的微型化环境中执行。因此，本专利技术的一个目的是在小型化环境中实现高效的核酸纯化，例如，使用微流体设备或使用磁性毛细管阀，其中，洗涤步骤和洗脱步骤分别在≤500μl或≤50μl的条件下执行。参考下文描述的(一个或多个)实施例，本专利技术的这些方面和其他方面将变得明显并且得到阐明。附图说明图1磁性毛细管阀筒，左图：磁性毛细管阀筒的分解图(顶部)和组装图(底部)的方案，数字1-4表示不同的室；右图：组装的筒。图2是使用MCV的ivRNA产量比较结果：黑色柱：通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：通过单一缓冲溶液方法获得的RNA产量。图3是使用Eppendorf管的ivRNA产量比较结果：(a)黑色柱：使用珠通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：通过使用珠的单一缓冲溶液方法获得的RNA产量；(b)当利用参考方法(黑色柱)或单一缓冲溶液方法(灰色柱)使用珠时，x轴上指示的不同组分中检测到的RNA百分比；(c)黑色柱：使用硅石颗粒通过参考方法获得的RNA产量；灰色柱：使用硅石颗粒通过单一缓冲溶液方法获得的RNA产量；(d)当利用参考方法(黑色柱)或单一缓冲溶液方法(灰色柱)使用硅石颗粒时，x轴上指示的不同组分中检测到的RNA百分比。具体实施方式本专利技术描述了缓冲溶液以及方法和试剂盒，其用于使用单一缓冲溶液进行洗涤和洗脱，并因此用于高效纯化核酸分子。尽管将关于特定实施方案描述本专利技术，但是该描述不应被解释为限制意义。在详细描述本专利技术的示例性实施例之前，给出用于理解本专利技术的重要的定义。如在说明书和权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则“一”、“一个”和“该”也包括多个。还应当理解，术语“包括”、“例如”和“诸如”不是限制性的。术语“可能”既不被理解为强制性的，也不被理解为限制性的。术语“任选地”应当被理解为替代方案或说明书。术语“尤其”被认为是本专利技术的优选实施例。如本文中所使用的，术语“单一缓冲溶液”或“单一洗涤和洗脱缓冲溶液”是指具有相同组成、组分比例和特性的缓冲溶液。术语“暴露/暴露于”和“结合/结合到”是指在样品的核酸能够结合核酸结合相的条件下使样品与核酸结合相接触。在本专利技术的某些实施例中，“结合/结合到”意指样品中存在≥25％的核酸结合，或样品中存在≥50％，或≥75％，或≥85％，或≥95％的核酸结合。术语“洗涤/洗涤出”或“洗涤/洗涤步骤”是指结合之后的情况，其中，在很大程度上从与核酸结合相结合的核酸中除去来自裂解或结合流程的杂质(例如，碎片(例如，细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于纯化核酸的方法，包括以下步骤：(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，(iii)使用≤50μl的步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.28 EP 15202803.11.一种用于纯化核酸的方法，包括以下步骤：(i)将包括核酸的样品暴露于核酸结合相并允许所述核酸结合到所述核酸结合相，(ii)用包括缓冲剂的缓冲溶液洗涤结合到所述核酸结合相的所述核酸至少一次，(iii)使用≤50μl的步骤(ii)的所述缓冲溶液从所述核酸结合相洗脱所述核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液的特征在于盐浓度≤100mM，优选为≤50mM，更优选为≤30mM，最优选为≤10mM。3.根据权利要求1或2中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液的特征在于pH≥7.5，优选为pH≥9。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)和步骤(iii)的所述缓冲溶液中的所述缓冲剂是Tris-HCl。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中，步骤(ii)在≤40μl，优选为≤30μl，更优选为≤25μl，并且最优选为≤20μl的所述缓冲溶液中执行。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，步骤(iii)在≤15μl，优选为≤10μl，最优选为≤5μl的所述缓冲溶液中执行。7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，将结合到所述核酸结合相的所述核酸用所述缓冲溶液洗涤至少一次，优选洗涤两次。8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，所述核酸是DNA或RNA，优选是病毒DNA或病毒RNA。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中，所述样品包括真核细胞，优选为人类细胞，更优选为上皮细胞。10.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中，所述样品包括在步骤(i)之前裂解的细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述样品还包括细菌和/或病毒。12.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中，所述核酸结合相包括硅石。13.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中，所述核酸结合相包括磁性颗粒。14.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中，所述方法利用微流体设备来执行。15.根据权利要求1至14中的任一项所述的方法，其中，所述方法利用磁性毛...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·S·范达默，W·H·鲍曼，
申请(专利权)人：皇家飞利浦有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL