本发明专利技术提供一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针能够特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括下列之一：表1所示147个基因中的至少之一；或表1中所述至少一种基因的CDS区域；或表1中所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10‑200bp的区域。发明专利技术还提供试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法、一种检测目标区域变异的方法及系统。利用本发明专利技术的试剂盒和/或本发明专利技术的方法及系统，能够一次性、简单方便且高特异性的获取肺癌的相关基因序列，能够准确检测分析这些相关基因序列，使检测分析结果可以辅助用于肺癌的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体的，涉及试剂盒及其用途，更具体的，本专利技术涉及一种试剂盒、试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法以及一种检测目标区域变异的方法及系统。
技术介绍
原发性肺癌(以下简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示,2010年,我国新发肺癌病例60.59万(男41.63万,女性18.96万),居恶性肿瘤首位(男性首位,女性第2位),占恶性肿瘤新发病例的19.59％(男性23.03％,女性14.75％)。肺癌发病率为35.23/10万(男性49.27/10万,女性21.66/10万)。同期,我国肺癌死亡人数为48.66万(男性33.68万,女性16.62万),占恶性肿瘤死因的24.87％(男性26.85％,女性21.32％)。肺癌死亡率为27.93/10万(男性39.79/10万,女性16.62/10万)。肿瘤的发生发展是一个长期缓慢的过程，目前肿瘤诊疗的困境主要在于：早期诊断困难，错过最佳治疗时机；易复发转移，预后较差；放化疗易产生耐受及缺乏有效的治疗靶点等。肿瘤的防控重在预防。统计显示，癌前阶段的筛查可实现接近100％的预防，早期癌症可实现80％的治愈率，晚期癌症的五年生存率仅有30％。因此早期筛查是遏制多种肿瘤高发的有效措施之一。因此做到肿瘤的早诊早治，实时监控及个体化诊疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键。因此寻找用于对肿瘤早期筛查及预后复发监测的特异肿瘤标志物成为重要的课题。循环DNA是存在于血液、滑膜液等体液中的细胞外游离DNA，研究发现许多肿瘤患者循环DNA与正常人相比有很大差异，由于肿瘤细胞凋亡，癌症患者循环DNA中含有一定的肿瘤标志物。近年来肿瘤患者血液中循环游离DNA的基因检测诊断已成为研究热点，研究显示血液中循环肿瘤DNA有可能成为一种新的肿瘤早期诊断及预后判断的标志物。检测血液中循环游离DNA中的肿瘤标志物检测具有区别于传统组织肿瘤标志物检测方式，具有无创、随时监控和早期筛查等优势，并且对循环游离DNA的取样检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种很有潜力的肿瘤标志物。如今高通量测序技术已经在医学研究中得到了广泛应用，但由于肺癌发病早期的血浆游离DNA含量较低，而且测序技术本身存在一定的错误率等，因此传统的测序方法将无法分辨测序错误和肿瘤标本中低频率突变，因此开发易操作、低损伤、高准确的技术是肺癌早期检测研究领域攻克的难点。
技术实现思路
依据本专利技术的一方面，本专利技术提供一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者游离于溶液中，所述探针能够特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括下列之一：表1所示147个基因中的至少之一；或表1中所述至少一种基因的CDS区域；或表1中所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10-200bp的区域。本专利技术另一方面提供一种构建目标区域测序文库的方法，所述方法包括：(1)获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个DNA片段组成，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段，所述短序列DNA片段具有平末端；(2)加碱基“A”至所述DNA片段的3’端，获得具有粘性末端A的DNA片段；(3)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；(4)利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；(5)利用上述试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；以及，(6)利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述目标区域测序文库。本专利技术另一方面提供一种测序方法，所述方法包括：根据上述构建目标区域测序文库的方法构建目标区域测序文库；对所述目标区域测序文库进行测序，获得测序数据，所述测序数据由多个读段组成；其中，在NextSeq CN500上进行所述测序。本专利技术另一方面提供提供一种检测目标区域变异的方法，所述方法包括：(1)利用上述测序方法，获得测序数据，对所述测序数据进行过滤，所述过滤包括去除掉不确定碱基比例超过10％的读段和/或碱基质量值不大于5的碱基数的比例不小于50％的读段；(2)将所述测序数据与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果，去除掉第一比对结果中的一个读段对中的两个读段相同的读段对；将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；对所述比对结果进行再过滤，所述过滤包括去除掉比对中错配碱基数多于3个读段，获得所述目标区域中的SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少之一；其中所述参考序列为HG19，所述参考序列的一部分包括目标区域参考序列中的每个已知InDel位点导致的错配区域。本专利技术另一方面提供一种检测目标区域变异的系统，包括，核酸获取装置，用于获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个DNA片段组成，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段，所述DNA片段具有平末端；加碱基A装置，用于加碱基“A”至所述DNA片段的3’端，获得具有粘性末端A的DNA片段；接头连接装置，用于连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；第一扩增装置，用于利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；捕获装置，用于前述含有探针的任一试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；以及，第二扩增装置，用于利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物；测序装置，用于将所述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包括SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少一种。本专利技术的方法，是一种高灵敏性、高特异性、高通量的方法，能够辅助用于肺癌的相关基因的科学研究。通过使用新一代高通量测序技术，结合本专利技术一方面的试剂盒包含的能特异性捕获特定目标区域的探针，能够在很短的时间内同时进行多例样本检测，并且可以基于相同数据量进行更高深度的数据挖掘，检测结果特异性高，具较低的假阳性率、假阴性率，能够确保得到的检测结果能够准确的反应受检者的实时外周血状况。而且此芯片中的探针集不仅可以灵活的挑选检测基因，还能随着导致肺癌新基因的发现，加入新的基因，具有很高的性价比和针对性。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术的一个实施例，构建目标区域测序文库的方法的流程图。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种测定目标区域变异的方法。具体而言，本专利技术人根据现有疾病基因的信息，设计了固定有多种疾病特异性探针的核酸芯片；对待测样本中游离的、片段化的、源自基因组DNA的双链核酸分子的末端加入接头，并进行富集；用核酸芯片对含接头的DNA片段进行捕获，将捕获的片段在高通量测序平台进行测序，基于已知的基因位点信息，对测序结果进行分析，得到目标区域核酸变异的信息。本专利技术中的“变异”、“核酸变异”、“基因变异”可通用，本专利技术中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“插入缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义，但本专利技术中对各种变异的大小不作特别限定，这样这几种变异之间有的有交叉，比如当插入/缺失的为大片段甚至整条染色体时，也属于发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括：表1所示147个基因中的至少之一；或表1中所述至少一种基因的CDS区域；或表1中所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10‑200bp的区域。
【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括：表1所示147个基因中的至少之一；或表1中所述至少一种基因的CDS区域；或表1中所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10-200bp的区域。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为全人工合成或体外克隆合成，所述探针的长度为20-120mer。3.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述探针的制备包括如下步骤：确定所述目标区域的参考序列；从所述参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考序列的另一端；将所述DNA片段与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的比对次数，过滤掉比对次数超过1的DNA片段；去除掉GC含量不在30-80％的DNA片段。4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在获取肺癌相关基因序列中的用途。5.一种构建目标区域测序文库的方法，其特征在于，包括：(1)获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个DNA片段组成，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段，所述DNA片段具有平末端；(2)加碱基“A”至所述DNA片段的3’端，获得具有粘性末端A的DNA片段；(3)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；(4)利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；(5)利用权利要求1-3任一项所述的试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；以及，(6)利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述目标区域测序文库。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样本来源于人或动物；所述目标区...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩颖鑫，张印新，王佳伟，高晓峘，张春生，李胜，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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