一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法。本发明专利技术方法对皮肤类器官施以1

【技术实现步骤摘要】
一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法。

技术介绍

[0002]生命的进展过程中，皮肤的物理变化是体现机体老化的首要观察结果。长久以来，人们致力于通过各种抗衰老方法来改善皮肤的质量。通常认为，皮肤的老化是由外在因素(环境方面包括紫外线照射、空气污染、吸烟或营养缺乏)和内在因素(例如细胞老化和荷尔蒙变化)共同决定的，这些因素都会导致皮肤功能和再生潜力的丧失。特别是，内在皮肤老化是一个随年龄增加而不可避免的加剧的过程，其主要因素包括活性氧(ROS)的形成(加速皮肤老化，水分流失)、端粒磨损加速或基质金属蛋白酶(MMP)表达增加(结构完整性丧失，拉伸强度和弹性下降)，这些因素都会导致皮肤形态发生变化。此外，炎症性皮肤疾病和难愈合伤口，也是一直困扰人们的皮肤缺陷问题。
[0003]对于上述皮肤衰老或缺陷问题，目前采用的改善策略包括使用化学、生物或物理手段的局部非侵入性和侵入性策略。非侵入性策略主要以化妆品、化学换肤和光疗的方式出现。从功效方面看，以抗氧化剂和细胞调节剂为主的化妆品可用于增强皮肤对ROS引起的氧化应激保护。激光治疗策略能够产生胶原蛋白和弹性蛋白、重塑真皮以及减少色素和红斑等，但并不是每个人的皮肤都适用，相当多的人会产生强烈的副作用。在侵入性策略中，微针疗法用于将药物跳过皮肤屏障直接输送到真皮层中，与非侵入性策略相比，具有更直接的效果，但持续时间较短，而且会一定程度造成皮肤受损，甚至会引起皮肤炎症。此外，2000年初兴起的干细胞疗法也曾广泛应用于皮肤治疗。然而，干细胞治疗的安全性和有效性一直存在争议，一些研究表明干细胞本身并不参与治疗过程且注入缺陷部位的干细胞显示出低细胞活力。因此，目前的主流皮肤抗衰策略或多或少都会存在一些安全性和有效性的问题，并不适用于每一个人。因此，开发个体化的皮肤质量改善策略是未来皮肤护理的一大趋势。
[0004]外泌体是细胞分泌的直径30～150nm的双层磷脂囊泡，其携带包括脂质、蛋白质和核酸在内的多种生物分子。外泌体可以由大多数类型的细胞分泌，但不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，且不同的细胞分泌的外泌体的量也是不同的。最近的研究表明外泌体在改善皮肤缺陷(如老化、特应性皮炎和伤口)和修复屏障敏感中具有一定的功效。与干细胞治疗相比，外泌体治疗不是直接用异体细胞来取代自体细胞从而发挥治疗效果，仅是提高和促进原本细胞的功能的和自我修复能力，主要优势是接受者的排斥风险最小。因此使用外泌体可以避免由于细胞成分引起的生物学上的一些风险以及伦理问题。
[0005]目前在皮肤护理领域展开研究的外泌体主要是来自人类多能诱导干细胞(IPSC)、骨髓间充质干细胞(MSC)和人真皮成纤维细胞(HDF)，其都是单一细胞类型分泌的外泌体，由于不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，因此并没有真正实现精准化、个体化皮肤护理。此外，外泌体的浓度和量也会对皮肤护理的效果产生很大的差异。由
于皮肤是由多种类细胞组成的高度复杂的器官，因此单一细胞类型产生的外泌体成分相较完整皮肤分泌的具有很大的差异，而人体的真正皮肤组织目前还不能在体外长期培养以分泌外泌体，这会涉及到伦理学方面的问题。
[0006]综上所述，有必要提出一种新的外泌体制备策略，用于缓解现有技术中存在的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的旨在提供一种促进皮肤类器官分泌外泌体的方法，具体技术方案如下。
[0008]一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法，所述方法使用物理
‑
生理联用刺激皮肤类器官分泌出外泌体，具体步骤如下：
[0009]步骤1：制备皮肤类器官；
[0010]步骤2：将制备好的皮肤类器官解离为30
‑
50μm尺寸大小(以增大皮肤类器官的表面积)；
[0011]步骤3：对步骤2中解离的皮肤类器官施以1
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3轮的物理
‑
生理联用刺激，所述物理
‑
生理联用刺激为采用物理手段和生理手段协同联用，所述物理手段包括机械刺激和动态培养，所述生理手段为饥饿刺激；每轮的所述物理
‑
生理联用刺激操作依次为饥饿刺激2天、机械刺激2天和动态培养3天；
[0012]步骤4：收集步骤3中经过1
‑
3轮物理
‑
生理联用刺激操作后的培养上清液，用差速离心结合超高速离心的方式收集所述上清液中的外泌体。
[0013]进一步，所述机械刺激为将皮肤类器官置于压力环境下培养；所述饥饿刺激为将皮肤类器官置于无糖基础培养基上培养；所述动态培养为将皮肤类器官置于摇动环境下培养。
[0014]进一步，所述机械刺激为将皮肤类器官置于15
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40kpa/300mmHg的压力环境下培养。
[0015]进一步，所述无糖基础培养基包括无糖DMEN培养基、无糖DMEM/F12培养基或SILAC Advanced DMEM/F
‑
12Flex培养基。
[0016]进一步，所述动态培养为将皮肤类器官置于动态摇床上以30
‑
50rpm摇动培养。
[0017]进一步，对所述步骤3中的皮肤类器官进行一共3轮的物理
‑
生理联用刺激。
[0018]进一步，所述皮肤类器官包括人源组织来源的皮肤类器官和鼠源组织来源的皮肤类器官。
[0019]进一步，所述人源组织来源的皮肤类器由人体全层皮肤组织消化后具有干性的细胞培养，所述具有干性的细胞包括真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞，其比例为9:1～1:1(包括9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1)。
[0020]进一步，所述所述人源组织来源的皮肤类器的培养基包括Advanced DMEM/F12、5％
‑
10％血小板裂解物(hpL)、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、1％N2(N2补充剂)、1％B27(B27添加剂)、10Mm HEPES(4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸)、1％GlutaMAX(L
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丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺)、1％青霉素/链霉素(P/S)、1mM N
‑
Acetyl
‑
L
‑
cysteine(N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸)、1uM A83
‑
01(TGF
‑
βI型受体抑制剂)、10uM Forskolin(毛喉素)、50ng/mL EGF(表皮生长因子)、100ng/mL FGF
‑
10
(成纤维细胞生长因子10)、100ng/mL Noggin(BMP骨形态发生蛋白的内源性抑制剂)、250ng/mL R
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺激皮肤类器官分泌外泌体的方法，其特征在于，所述方法使用物理
‑
生理联用刺激皮肤类器官分泌出外泌体，具体步骤如下：步骤1：制备皮肤类器官；步骤2：将制备好的皮肤类器官解离为30
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50μm尺寸大小；步骤3：对步骤2中解离的皮肤类器官施以1
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3轮的物理
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生理联用刺激，所述物理
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生理联用刺激为采用物理手段和生理手段协同联用，所述物理手段包括机械刺激和动态培养，所述生理手段为饥饿刺激；每轮的所述物理
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生理联用刺激操作依次为饥饿刺激2天、机械刺激2天和动态培养3天；步骤4：收集步骤3中经过1
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3轮物理
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生理联用刺激操作后的培养上清液，用差速离心结合超高速离心的方式收集所述上清液中的外泌体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述机械刺激为将皮肤类器官置于压力环境下培养；所述饥饿刺激为将皮肤类器官置于无糖基础培养基上培养；所述动态培养为将皮肤类器官置于摇动环境下培养。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述机械刺激为将皮肤类器官置于15
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40kpa/300mmHg的压力环境下培养。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无糖基础培养基包括无糖DMEN培养基、无糖DMEM/F12培养基或SILAC AdvancedDMEM/F
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12Flex培养基。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动态培养为将皮肤类器官置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉，陆政昊，李胜，刘虹余，杨云旭，何春花，龚刘萍，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：