一种血管化肿瘤类器官的培养方法及应用技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种血管化肿瘤类器官的培养方法及应用。本发明专利技术方法为在体外诱导肿瘤类器官血管形成，包括取患者的活检组织制成混合细胞团，然后用所述混合细胞团分别培养出肿瘤细胞和内皮细胞，最后再将所述肿瘤细胞和内皮细胞进行3D共培养，在共培养出的肿瘤类器官内部诱导生成血管网络。共培养出的肿瘤类器官内部诱导生成血管网络。共培养出的肿瘤类器官内部诱导生成血管网络。

【技术实现步骤摘要】
一种血管化肿瘤类器官的培养方法及应用
[0001]本申请要求2022年10月11日提交的中国专利技术专利申请【CN2022112413917】、名称为“一种血管化肿瘤类器官的培养方法和应用”的优先权，并以引用方式全文并入。


[0002]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种血管化肿瘤类器官的培养方法及应用。

技术介绍

[0003]研究发现，肿瘤在发生、发展的过程中会在其内部形成大量的新生血管，这些新生的血管为肿瘤提供生长所需的营养和水分，同时为向远处扩散肿瘤细胞，在体内不同部位形成新的转移灶创造条件。以乳腺癌为例，乳腺癌具有的高增殖和转移特性依赖于不断形成的新生血管，因此抑制血管生成是攻克乳腺癌肿瘤微环境侵袭性的关键研究内容。已有的研究共识蹴就了建立“肿瘤
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血管生成模型”的概念，但目前的大部分研究是将脐静脉内皮细胞(HUVEC)、间充质细胞(MSC)等作为血管内皮的来源，加入乳腺癌细胞系，进行动物体外移植瘤模型，以达到生成血管目的。用这种方法建立的模型，首先还是要依赖于动物，即需要在动物身上进行移植，因此建模周期长，成本高。其次，由于HUVEC和MSC细胞系经过了长期的培养与传代，其分子与表型特征已经出现改变，因此用HUVEC和MSC细胞系与乳腺癌细胞系共培养时，往往面临由于细胞株缺乏肿瘤微环境中血管的特性而导致其不能完全模拟体内的肿瘤与血管之间的相互作用的微环境，也不具备不同患者之间的肿瘤异质性。因此，基于HUVEC和MSC构建的“肿瘤
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血管生成”动物模型往往不能完全有效地向临床转化。
[0004]近年来发展起来的肿瘤类器官(Patient
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derived tumor organoid,PDO)模型由于具备可维持肿瘤异质性的特征和较高的建模成功率，因此被广泛用于临床前肿瘤研究和临床药物筛选。目前的研究认为肿瘤类器官有潜力作为一种体外检测平台用于预测个体化免疫治疗的反应。然而，由于缺乏体内重要的生理过程，以及缺乏免疫细胞和间充质细胞等微环境，体外构建的类器官不能完全复制真正器官的所有细胞类型和成熟度，也没有血管、淋巴管和神经系统的分布，进而导致类器官模型难以评估免疫调节剂真实的治疗反应和药物机理。
[0005]目前虽然已有尝试用内皮细胞与类器官进行共培养以诱导类器官血管生成的技术方案，但是这些技术方案操作复杂，培养时间长，同时不能解决保持不同患者原始肿瘤组织的异质性遗传的问题。例如申请号为CN2018800224776，专利技术名称为“稳定的三维血管形成和形成其的方法”的专利，公开了一种将类器官或脱细胞器官与包含编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞在使内皮细胞中表达外源ETV2蛋白的条件下培养，以使类器官或脱细胞器官血管化的技术方案。该技术方案首先需要用至少3
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4周来构建一种能编码ETV2转录因子的外源核酸的内皮细胞(即构建一种特制的内皮细胞)，且该方法中的内皮细胞来源包括HUVEC细胞系(缺乏肿瘤微环境血管特性)。完成上述内皮细胞的构建后，进一步与类器官共培养，在培养条件下所述内皮细胞需要表达出ETV2蛋白才能诱导形成管腔化的、稳定
的三维血管。可见，该专利方法提供的构建稳定三维血管形成的技术方案操作复杂，耗时较长。更重要的是，该专利方法是将在体外构建的血管化类器官通过手术方式植入患者体内，而不是在体外构建一个用于临床前药物筛选的平台。
[0006]综上，目前亟需开发一种能够接近不同患者肿瘤血管生成特性并为临床前筛选抗血管生成药物提供有效支撑的方法及模型，以期缓解现有技术中的至少一个问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种诱导肿瘤类器官血管化的培养方法及应用，具体技术方案如下。
[0008]一种诱导肿瘤类器官血管形成的培养方法，包括以下步骤：
[0009]步骤一：取患者的活检组织，清洗后剪碎，然后进行组织消化，0.5
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2h后终止所述组织消化以获得混合细胞团(此时的细胞团包括肿瘤细胞、少量的内皮细胞以及免疫细胞和基质细胞等，所以称为混合细胞团)；
[0010]步骤二：将所述步骤一获得的混合细胞团制成细胞悬液，加入基质胶重悬沉淀后接种于孔板中，加入肿瘤细胞培养基扩增培养出肿瘤细胞，待所述肿瘤细胞密度融合至少80％后进行传代(在普通光学显微镜下观察，在同一个视野下计算肿瘤类器官总数以及相互融合的细胞总数即获得融合比例，统计多个视野获得细胞密度融合比例的平均值)；
[0011]步骤三：将所述步骤一获得的混合细胞团制成细胞悬液，加入内皮细胞培养基重悬沉淀后接种于明胶包被的培养板中，培养得到内皮细胞，待所述内皮细胞密度融合至少80％后进行传代(细胞密度融合百分比计算同步骤二)；
[0012]步骤四：进一步扩增培养所述步骤三获得的内皮细胞，用免疫磁珠进行磁性筛选或用流式细胞仪对内皮细胞进行纯化至纯度达到90％以上(内皮细胞的纯度会影响实验结果的准确性。由于从患者活检组织中消化得到的混合细胞团中含有包括肿瘤细胞、免疫细胞，基质细胞等的其他细胞，因此采用磁珠分选或流式细胞仪分选以达到纯化目的，以提高实验的准确性)；
[0013]步骤五：将所述步骤二获得的肿瘤细胞和所述步骤四获得的内皮细胞混合重悬于基质胶中，所述基质胶中重悬的混合细胞比例为4000
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10000个/25μl，进一步接种到共培养培养基中进行3D共培养，所述共培养培养基由FBS、青/链霉素、L
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Glutamate、DMEM/F12基础培养基和促血管生成组分组成，所述促血管生成组分包括VEGF和维生素C(此时的共培养过程中包含两个过程：形成肿瘤类器官和经内皮细胞诱导后在肿瘤类器官内部和类器官之间形成血管网络)；
[0014]步骤六：对共培养体系中生成的血管进行免疫荧光染色鉴定。
[0015]可以理解的是，本方法中采用的肿瘤细胞培养基根据不同的肿瘤组织来源而成分有所差异，培养基成分均参照现有文献资料进行配置，以实现肿瘤细胞形成肿瘤类器官的培养目的。
[0016]本专利技术方法中的“共培养”是将肿瘤细胞与内皮细胞进行3D共培养。如果仅是将两种细胞混合后进行常规的2D共培养，极有可能会导致肿瘤细胞与内皮细胞互相挨着贴壁生长，进而不能有效的分化出血管。但形成3D结构后，肿瘤细胞形成肿瘤类器官，内皮细胞诱导肿瘤类器官的血管生成，可能会在肿瘤类器官团块中间或者团块与团块之间形成血管网
络，从而模拟出肿瘤类器官的部分微环境，使其在体外平台构建出一种更接近于肿瘤实际行为模式的模型，为后续的临床前药物筛选提供更高的准确度。
[0017]进一步，所述步骤五中肿瘤细胞和内皮细胞的混合比例为1：1～1：2。
[0018]优选的，所述肿瘤细胞和所述内皮细胞的混合比例包括1:1或1:2。
[0019]进一步，所述步骤一中用清洗液清洗患者活检组织，所述清洗液包含体积比为1％青/链霉素和99％ DPBS缓冲液。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外诱导肿瘤类器官血管形成的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取患者的活检组织，清洗后剪碎，然后进行组织消化，0.5
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2h后终止所述组织消化以获得混合细胞团；步骤二：将所述步骤一获得的混合细胞团制成细胞悬液，加入基质胶重悬沉淀后接种于孔板中，加入肿瘤细胞培养基扩增培养出肿瘤细胞，待所述肿瘤细胞密度融合至少80％后进行传代；步骤三：将所述步骤一获得的混合细胞团制成细胞悬液，加入内皮细胞培养基重悬沉淀后接种于明胶包被的培养板中，培养得到内皮细胞，待所述内皮细胞密度融合至少80％后进行传代；步骤四：进一步扩增培养所述步骤三获得的内皮细胞，用免疫磁珠进行磁性筛选或用流式细胞仪对内皮细胞进行纯化至内皮细胞纯度达到90％以上；步骤五：将所述步骤二获得的肿瘤细胞和所述步骤四获得的内皮细胞混合重悬于基质胶中，所述基质胶中重悬的混合细胞比例为4000
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10000个/25μl，进一步接种到共培养培养基中进行3D共培养，所述共培养培养基由FBS、青/链霉素、L
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Glutamate、DMEM/F12基础培养基和促血管生成组分组成，所述促血管生成组分包括VEGF和维生素C；步骤六：对共培养体系中生成的血管进行免疫荧光染色鉴定。2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤五中肿瘤细胞和内皮细胞的混合比例为1：1～1：2。3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤一中用清洗液清洗患者活检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘虹余，何春花，李胜，陆政昊，王嘉，杨云旭，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：