一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法及应用技术

本发明专利技术属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法及应用。本发明专利技术方法采用剥离整块食管固有腺组织

【技术实现步骤摘要】
一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法及应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法及应用。

技术介绍

[0002]食管壁分为黏膜、黏膜下层、肌层和外膜四层。其中，食管固有腺多数位于食管黏膜下层的疏松结缔组织中，是一种粘液型外分泌腺。此腺开口于粘膜的上皮表面，其分泌物经导管排入食管腔，起保护及滑润作用。
[0003]食管腺癌作为一个死亡率高、发病率尚呈上升趋势的癌种，急需相应的实验模型来探究食管腺癌的来源及分子机制。目前的观点认为，食管腺癌很可能起源于Barrett食管中未分化的细胞，但对于Barrett食管的来源尚存在争议，可能来源于食管固有腺、贲门等各种特定细胞群。该研究的一个主要障碍在于，啮齿类的胃食管生理结构与人类不完全相似，大鼠、小鼠等标准化实验动物的食管与鳞状前胃角质化并缺少食管固有腺，基于多种原因，食管腺癌的研究不如其他肿瘤研究一样可以顺利的在动物模型上开展。
[0004]同时，有文献表明，在各类食管疾病(如反流性食管炎或Barrett食管消融治疗后)中，患病部位的食管固有腺存在显著的增殖，它可能以正常或异常方式修复受损的上皮细胞。本专利可提供一种体外类器官模型，用于评估在食管疾病中损伤上皮再生中的驱动因素。
[0005]申请号为CN2020106845242，专利技术名称为构建原位原发食管癌动物模型的方法专利公开了一种将小鼠食管细胞以特定培养基培养为食管类器官的技术。该专利直接消化小鼠食管，取小鼠食管细胞进行类器官培养，然而小鼠不具有食管固有腺组织，因此仅用小鼠食管细胞培养出的类器官无法开展人体食管固有腺体相关疾病的研究，特别是食管腺癌，因其多被认为是一类来源于腺上皮组织的恶性肿瘤，目前对食管腺癌的研究和治疗都还处在较为初期的阶段。
[0006]此外，人体的食管固有腺因其分布较为稀少、肉眼难以区分且与食管壁的黏膜下层紧密结合，导致分离和富集都很困难，总的来说目前国内外关于食管固有腺相关的研究都相对较少，国内尚无分离食管固有腺的相关文献及专利报道。虽然目前国内外有一些在细胞及RNA层面上对食管固有腺与Barrett食管、食管腺癌相关分子机制进行研究的报道，但尚未见培养食管固有腺类器官的报道。
[0007]基于此，本专利技术提出一种体外培养人食管固有腺的方法，以补充现有技术的不足。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法及应用，具体技术方案如下。
[0009]一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法，包括剥离整块食管固有腺组织
‑
固有腺组织块富集
‑
固有腺类器官培养，具体步骤如下：
[0010]步骤1：取人食管黏膜组织，尽量剥离出整块食管固有腺组织；
[0011]步骤2：富集步骤1剥离出的食管固有腺组织，加入富集培养基，所述富集培养基包括DMEM培养基、细胞因子和腺体组织富集组合物，所述腺体组织富集组合物包括EGF和ITS，所述细胞因子包括胃泌素和FBS/Noggin；
[0012]步骤3：将步骤2富集培养的食管固有腺组织接种到Matrigel基质胶并加入食管固有腺培养基进一步培养为食管固有腺类器官，所述食管固有腺类器官培养基包括Advanced DMEM/F12培养基、细胞因子和腺体类器官生长组合物，所述腺体类器官生长组合物包括重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人胰岛素样生长因子
‑
1，所述细胞因子包括Y27632、N2补充剂、B27添加剂、Noggin、N
‑
乙酰半胱氨酸、A83
‑
01、胃泌素、烟酰胺、EGF、FGF
‑
10、L
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丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺、R
‑
Spondin和Wnt3A中的一种或多种。
[0013]进一步，步骤1中取人食管黏膜组织，拉伸所述人食管黏膜组织的粘膜下层，使其变薄透光，然后选取橄榄状的组织进行剥离。
[0014]进一步，步骤2中所述食管固有腺组织与富集培养基的比例为4
‑
5个食管固有腺组织加入1
‑
3ml富集培养基。
[0015]进一步，步骤2中的细胞因子包括胃泌素和FBS或胃泌素和Noggin。
[0016]进一步，步骤2中加入富集培养基富集出的食管固有腺组织中固有腺细胞的纯度为大于等于57％。
[0017]进一步，步骤3中所述腺体类器官生长组合物包括50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子和100ng/ml重组人胰岛素样生长因子
‑
1；所述细胞因子包括10
‑
50uM Y27632，(1x)N2补充剂，(1x)B27添加剂，100
‑
1000ng/mL Noggin，1
‑
2mM N
‑
乙酰半胱氨酸，200
‑
500nM A83
‑
01，1
‑
5nM胃泌素，10
‑
50mM烟酰胺，50
‑
100ng/mL EGF，500
‑
1000ng/mL FGF
‑
10，(1x)L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，1250
‑
5000ng/mL R
‑
Spondin和250
‑
500ng/mL Wnt3A中的一种或多种。
[0018]由上述方法制备得到的食管固有腺类器官，所述食管固有腺类器官中的固有腺细胞纯度为大于等于98％。
[0019]上述食管固有腺类器官在制备人体食管腺癌模型中的应用。
[0020]上述食管固有腺类器官在制备人体食管疾病模型中的应用。
[0021]进一步，所述人体食管疾病模型包括反流性食管炎模型、药物性食管炎模型、腐蚀性食管炎模型或Barrett食管模型及Barrett食管消融治疗后模型。
[0022]在一些具体实施例中，本专利可提供一种体外食管固有腺类器官模型，用于评估在各类食管疾病(如反流性食管炎、药物性食管炎、腐蚀性食管炎、Barrett食管及其消融治疗后)中损伤上皮再生中的驱动因素。
[0023]有益技术效果
[0024]本专利技术提出一种采用剥离整块人食管固有腺组织
‑
固有腺组织块富集
‑
固有腺类器官培养的方法组合，在固有腺组织块的富集过程中加入特定的腺体组织富集组合物(EGF和ITS)，在类器官的培养过程中加入特定的腺体类器官生长组合物(重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人胰岛素样生长因子
‑
1)，最后快速富集培养得到一种固有腺细胞纯度大于等于98％的食管固有腺类器官。该食管固有腺类器官可用于人食管腺癌的研究和各种疑难人食管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速富集培养食管固有腺类器官的方法，其特征在于，包括剥离整块食管固有腺组织
‑
固有腺组织块富集
‑
固有腺类器官培养，具体步骤如下：步骤1：取人食管黏膜组织，尽量剥离出整块食管固有腺组织；步骤2：富集步骤1剥离出的食管固有腺组织，加入富集培养基，所述富集培养基包括DMEM培养基、细胞因子和腺体组织富集组合物，所述腺体组织富集组合物包括EGF和ITS，所述细胞因子包括胃泌素和FBS/Noggin；步骤3：将步骤2富集培养的食管固有腺组织进一步培养为食管固有腺类器官，加入食管固有腺类器官培养基，包括AdvancedDMEM/F12培养基、细胞因子和腺体类器官生长组合物，所述腺体类器官生长组合物包括重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人胰岛素样生长因子
‑
1，所述细胞因子包括Y27632、N2补充剂、B27添加剂、Noggin、N
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乙酰半胱氨酸、A83
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01、胃泌素、烟酰胺、EGF、FGF
‑
10、L
‑
丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺、R
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Spondin和Wnt3A中的一种或多种。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中取人食管黏膜组织，拉伸所述人食管黏膜组织的粘膜下层，使其变薄透光，然后选取橄榄状的组织进行剥离。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述食管固有腺组织与富集培养基的比例为4
‑
5个食管固有腺组织加入1
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3ml富集培养基。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中的细胞因子包括胃泌素和FBS或胃泌素和Noggin。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中加入富集培养基富...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹旸，张珊，王健，李胜，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：