一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用。具体来说，本发明专利技术方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官的上清液来分三次对患者自体肿瘤浸润淋巴细胞进行3次扩增，分别是初级扩增、二级扩增和三级扩增，在较短时间内获得数量较多的肿瘤浸润淋巴细胞，且活性好。且活性好。且活性好。

【技术实现步骤摘要】
一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用。

技术介绍

[0002]肿瘤类器官是通过对患者的肿瘤组织进行三维培养得到的保留部分原始肿瘤特征的细胞团，其在基因组、转录组及免疫组化染色特点上浓缩了原始肿瘤的部分特征，多代培养后也能够较稳定地保持形态和遗传特征，因此成为了精准医疗研究中的新兴方向。然而类器官也有一定的局限，主要是不具备原始肿瘤中肿瘤细胞与免疫细胞在体内相互作用的肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)，因此类器官不能等同于含有多种细胞类型的真实组织系统。
[0003]借助肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)去辅助了解肿瘤免疫微环境从而协助免疫治疗研究已成为当下肿瘤研究的热点。TILs是指一组从血液中迁移到肿瘤中起作用的淋巴细胞，其对肿瘤细胞具有特定的功能，可用于研究对肿瘤的杀伤作用。
[0004]然而，原始肿瘤组织来源的TILs数量极少，体外快速扩增很困难。即使通过人工培养的方式扩增出一定的数量，也很难保持体外的杀伤活性和维持其在体外的长期活性。目前体外培养TILs的主流方法包括两种：在培养基中添加白细胞介素家族的细胞因子(包括IL
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2、IL
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9、IL
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21等)和不添加白细胞介素家族的细胞因子。其中，又以在培养基中添加IL
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2为主流，因其可以促进TILs在体外的快速扩增。例如，CN2016106323937、CN2020106469704、CN2021102926160。然而研究证明，高浓度IL
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2的加入会导致TILs中Treg细胞数量增多，从而造成免疫抑制，这样培养出的TILs并不适合用于类器官的后续相关研究。因此，目前也有在培养基中不添加IL
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2来培养TILs的研究和报道。例如，CN2021104689545公开了一种TIL细胞扩增培养基，该培养基中不含IL
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2，但包含了白细胞介素家族的其他细胞因子(IL
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5、IL
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9、IL
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21)和单克隆抗体、灵芝多糖、谷胱甘肽等添加剂。该专利公布的培养基成分复杂，其中用IL
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5、IL
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9和IL
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21的组合来刺激TIL细胞增殖，以替代IL
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2的作用，然而该专利培养出数量较多的TILs需要的时间较长。
[0005]综上所述，有必要提出一种快速扩增TILs的新策略。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用，具体技术方案如下。
[0007]一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，所述方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官上清液来协同扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞，具体步骤如下：
[0008]步骤1：取患者来源的肿瘤组织剪碎，加入消化液消化为单细胞混合物，所述单细胞混合物包括肿瘤细胞、(微量的)肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞；
[0009]步骤2：将步骤1中所述的肿瘤细胞培养为肿瘤类器官；
[0010]步骤3：收集步骤2中所述的肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液；
[0011]步骤4：将步骤1中所述的单细胞混合物进行离心，离心后弃掉上清，随后加入步骤3所述的类器官上清液并接种于细胞培养孔板中，所述类器官上清液与离心后的所述单细胞混合物的体积比为2：1(v/v)，所述类器官上清液对所述单细胞混合物里的肿瘤浸润淋巴细胞进行初级扩增；
[0012]步骤5：显微镜下观察到步骤4中的细胞培养孔板里每孔中的肿瘤浸润淋巴细胞开始形成聚集体并占据细胞培养孔板面积的至少60％时，将孔内的混合物转移至干净离心管中进行过滤，收集肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞；
[0013]步骤6：向步骤5收集得到的所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞中再次加入所述类器官上清液，所述类器官上清液与所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞混合物(肿瘤细胞+TILs混合物)的体积比为2:1(v/v)，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行二级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体。
[0014]由于自体肿瘤细胞上有可以刺激TILs生长的抗原，因此再结合该自体肿瘤细胞培养出的类器官所产生的上清液共同作用，进而实现对自体TILs的快速扩增培养。
[0015]可以理解的是，本专利技术所述的类器官上清液包括类器官细胞的分泌物。
[0016]进一步，向步骤6中的肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中加入2倍体积的所述类器官上清液，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行三级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第2聚集体。
[0017]进一步，所述步骤1中的其他细胞包括成纤维细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。
[0018]进一步，所述步骤1中的肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌或胃癌。
[0019]进一步，所述步骤2中培养肿瘤类器官的具体操作如下：
[0020]步骤1：将肿瘤细胞与基质胶按1:1的比例混匀并接种于细胞培养孔板中，于37℃、5％ CO2条件下放置；
[0021]步骤2：待步骤1中的培养物凝固后，加入无血清培养基和促进类器官生长的细胞因子或小分子培养3
‑
5天成为肿瘤类器官；所述促进类器官生长的细胞因子或小分子包括Heregulinβ
‑
1(重组人Heregulinβ
‑
1)、R
‑
Spondin(经典Wnt信号通路的激活因子)、Noggin(BMP骨形态发生蛋白的内源性抑制剂)、EGF(表皮生长因子)、FGF
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10(成纤维细胞生长因子10)、Wnt
‑
3a(Wnt3a重组蛋白)、Y27632(ROCK抑制剂)。
[0022]进一步，所述步骤3中收集肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液的操作为用移液器移取，移取完类器官上清液以后将新的无血清培养基加入类器官继续培养。
[0023]进一步，所述步骤1中加入消化液在水浴锅中消化10
‑
40min至肿瘤组织完全消化为单细胞混合物；或者加入I型和II型胶原酶消化为肿瘤细胞。
[0024]一种自体肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液在制备自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中的应用。
[0025]进一步，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中还可以包括自体肿瘤细胞。
[0026]进一步，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品可以是培养液或培养基。
[0027]有益技术效果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官上清液来协同扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞，具体步骤如下：步骤1：取患者来源的肿瘤组织剪碎，加入消化液消化为单细胞混合物，所述单细胞混合物包括肿瘤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞；步骤2：将步骤1中所述的肿瘤细胞培养为肿瘤类器官；步骤3：收集步骤2中所述的肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液；步骤4：将步骤1中所述的单细胞混合物进行离心，离心后弃掉上清，随后加入步骤3所述的类器官上清液并接种于细胞培养孔板中，所述类器官上清液与离心后的所述单细胞混合物的体积比为2：1，所述类器官上清液对所述单细胞混合物里的肿瘤浸润淋巴细胞进行初级扩增；步骤5：显微镜下观察到步骤4中的细胞培养孔板里每孔中的肿瘤浸润淋巴细胞开始形成聚集体并占据细胞培养孔板面积的至少60％时，将孔内的混合物转移至干净离心管中进行过滤，收集过滤后的肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞；步骤6：向步骤5收集得到的所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞中再次加入所述类器官上清液，所述类器官上清液与所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞混合物的体积比为2:1，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行二级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向步骤6中的肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中加入2倍体积的所述类器官上清液，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行三级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第2聚集体。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的其他细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨云旭，李胜，陆政昊，王嘉，何春花，刘虹余，龚刘萍，
申请(专利权)人：广州精科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：