基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，提供基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：从鸡外周血中分离出免疫细胞，并进行分选前样品处理；流式分选仪分选经过样品处理后的细胞；对经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞进行纯度检测，并将经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞与感染沙门菌后的巨噬细胞共培养，检测共培养后T细胞的IL

【技术实现步骤摘要】
基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法


[0001]本专利技术属于细胞分离培养领域，是一种T细胞体外分离及培养方法，是一种保证细胞纯度的单种类细胞的体外培养方法。

技术介绍

[0002]免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。T淋巴细胞是具有细胞免疫功能的细胞，对B细胞起促进作用，以及对免疫细胞起抑制、调整作用的细胞，所组成细胞群总称，又称胸腺依赖性淋巴细胞，是淋巴细胞主要组分。它具有多种生物学功能，比如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体。对于特异性抗原和促有丝分裂原应答反应，以及产生细胞因子等，使免疫效应扩大和增强。
[0003]流式分选技术是一种细胞分离技术，其原理是当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
[0004]免疫磁珠细胞分选法是把细胞用超级顺磁性的(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。小磁珠的优点：(1)对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养；(2)可直接上流式检测，不影响散射光。小磁珠的缺点：(1)需要很强的磁场来分离细胞；(2)分离速度很慢，得率不高；(3)一次性的分离柱，不能在普通试管进行；(4)成本昂贵。大磁珠的优点：(1)技术简单，分离可在试管中完成；(2)易于增减细胞用量；(3)速度快，得率高；(4)成本低。缺点：(1)对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养；(2)纯度低；(3)容易阻塞FCM的喷嘴。
[0005]鸡的T淋巴细胞对于抗沙门菌感染起着至关重要的作用，但是各种T细胞与抗原递呈细胞间的相互作用并不清楚，因此，我们迫切的需要一种能够放大单种细胞间相互作用的培养方法。流式分选能够分选出更高纯度的细胞，因此，建立一种基于流式分选下的细胞培养条件的确定显得尤为重要。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述的需求，本专利技术的目的在于建立一种基于流式分选下的T细胞体外培养技术，以满足高纯度细胞放大细胞间相互作用的需求。
[0007]本专利技术的一个目的在于通过流式分选得到高纯度的T细胞。
[0008]本专利技术的另一个目的在于确定流式分选后的T淋巴细胞的培养方法。
[0009]本专利技术提供的技术方案如下：
[0010]基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，包括以下步骤：从鸡外周血中分离出免疫细胞，并进行分选前样品处理；流式分选仪分选经过样品处理后的细胞；对经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞进行纯度检测，并将经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞与感染沙门菌后的巨噬细胞共培养，检测共培养后T细胞的IL
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6和IL
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1β产生情况，得到鸡原代T细胞。
[0011]进一步的，经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞的培养温度为37℃。
[0012]进一步的，经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的培养基中含有10％胎牛血清。
[0013]进一步的，对经过培养的CD3抗体阳性的T淋巴细胞提取RNA，采用qRT
‑
PCR方法对IL
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6和IL
‑
1β产生情况进行检测。
[0014]进一步的，qRT
‑
PCR方法采用的引物序列如下：
[0015][0016][0017]进一步的，qRT
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PCR反应体系如下：
[0018][0019]进一步的，对鸡外周血中分离出免疫细胞采用表面抗体Mouse anti
‑
chicken CD3
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PE标记。
[0020]进一步的，所述分选前样品处理包括以下步骤：
[0021]采用翅静脉采血法用肝素锂抗凝管收集鸡抗凝血；在离心管中贴壁加入分离液和新鲜抗凝血，离心后液体分层，用吸管缓慢吸出白膜层，将收集到的白膜层细胞用清洗液稀
释洗涤并离心；用PBS重悬细胞，并加入Mouse anti
‑
chicken CD3
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PE，吹打混匀，避光孵育，离心PBS重悬细胞。
[0022]进一步的，所述流式分选仪分选细胞包括以下步骤：
[0023]将经过处理后的免疫细胞悬液压入流式细胞以流动室进行检测，液流系统将样本悬液定位在光源的中心处，激发光学系统，当一个细胞流经过流式细胞仪器的激光束时，对散射和荧光检测器产生光脉冲，光脉冲随后被转化为电压脉冲；流式检测仪内的检测分析系统将脉冲信号转化为数字信号，计算出每个脉冲峰的高度、宽度和面积；进行FACS法细胞分选，分选CD3抗体阳性的T淋巴细胞。
[0024]进一步的，所述纯度检测包括以下步骤：
[0025]通过流式细胞术测定CD3
+
T细胞的纯度；用直方图或散点图显示流式细胞仪得到的数据；使用FSC
‑
SSC物理图圈定目标细胞群，排除多细胞团块的影响；通过H和A参数，取出粘连细胞，FSC
‑
W/SSC
‑
A通道圈定FSC
‑
W坐标50
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100所有细胞；通过圈出细胞所占总细胞的比例分析分选所得细胞的纯度。
[0026]本专利技术技术方案的进一步改进在于，所述分选细胞包括以下步骤：
[0027]1.采用翅静脉采血法用肝素锂抗凝管收集5mL鸡抗凝血并使用密度梯度离心法分离PBMCs。
[0028]将上述所得细胞用200μL含有1％ BSA的PBS重悬细胞，并加入2.5μL的Mouse anti
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chicken CD3
‑
PE，吹打混匀。4℃，避光孵育30min。
[0029]4℃，1000r/min，离心5min。弃上清，用2mL含PBS重悬细胞，上述条件离心，弃上清，洗涤三遍。用含2.5％BSA的PBS重悬细胞，将细胞转移至流式管中。并利用流式分选仪进行分选。
[0030]2.所述确定流式分选后的T淋巴细胞的培养方法
[0031]①
将细胞于不同温度下培养并比较死亡率；
[0032]②
将细胞于含不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：从鸡外周血中分离出免疫细胞，并进行分选前样品处理；流式分选仪分选经过样品处理后的细胞；对经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞进行纯度检测，并将经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞与感染沙门菌后的巨噬细胞共培养，检测共培养后T细胞的IL
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6和IL
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1β产生情况，得到鸡原代T细胞。2.根据权利要求1所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的T淋巴细胞的培养温度为37℃。3.根据权利要求1所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，经过流式分选仪分选后的CD3抗体阳性的培养基中含有10％胎牛血清。4.根据权利要求1所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，对经过培养的CD3抗体阳性的T淋巴细胞提取RNA，采用qRT
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PCR方法对IL
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6和IL
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1β产生情况进行检测。5.根据权利要求4所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，qRT
‑
PCR方法采用的引物序列如下：6.根据权利要求4所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，qRT
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PCR反应体系如下：PCR反应体系如下：7.根据权利要求1所述的基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法，其特征在于，对鸡外周血中分离出免疫细胞采用表面抗体Mouse anti
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chicken CD3
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【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，李桂琴，胡茂志，李求春，顾丹，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：