空间转录组建库测序方法及所用装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um的组织冷冻切片。本发明专利技术还同时提供了利用上述装置进行的空间转录组测序技术方法。本发明专利技术不仅能有效实现少量细胞中获取足够的RNA样品，避免测序结果的“均一”或者“整体”表征，还可以根据细胞异质性分辨组织中不同表型的细胞转录本信息的差异性，挖掘低丰度的转录本信息，从而为生物医药农学领域提供更精确和特定性高的转录本信息。

Method and device for sequencing space transcriptome database

The invention discloses a transcriptome sequencing device and chip space based on location information, including the cover glass and silicon in silicon based oligonucleotide microarray, oligonucleotide microarray with anchor probe; for placement of 10 ~ 50um thickness tissue frozen section between the cover glass and the silicon based oligonucleotide chip. The invention also provides a method for sequencing the space transcriptome by using the device. The invention not only can effectively achieve the small number of cells to obtain sufficient RNA samples, avoid the sequencing results of \homogeneous\ or \whole\ representation, can also according to the difference of cell heterogeneity resolution information of different types of cells in tissues of transcription, transcription of the mining of low abundance information, so as to provide more accurate and specific high the transcript information for the agricultural fields of biological medicine.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学、医学、农学等领域，尤其是一种利用芯片探针获取组织细胞空间位置信息的空间转录组建库测序技术。该技术可以根据细胞的位置，类别以及状态信息对细胞进行准确的、可重复的标记和分类，可以在保留细胞组织中的位置分布的从自然组织微环境下的活细胞中分离出RNA，通过高通量测序和生物信息分析等流程，一次性定量获得不同空间位置组织细胞的完整的表达谱。
技术介绍
转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组测序即对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA进行测序。通过新一代高通量测序，转录组测序能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。细胞是生命活动的基本功能单位，而在生物体内没有任何两个细胞是完全相同的。传统的转录组研究，绝大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微的差别，掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中特异性和细胞差异性。而针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术发展的终极挑战。目前我们正在步入一个单细胞转录组学时代，该研究方向会对生物学和医学产生深刻的影响。然而单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术(amplificationtechnology)也是一大考验。而且目前采用的单细胞测序技术中，绝大多数方法都需要特定的前处理过程，制备“测序文库”。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、操作失误率高、重复性差、背景噪声以及定量不准确等问题均造成单细胞测序难以广泛应用和推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于组织和芯片空间位置信息的、操作简便、成本相对较低、特异性强、分辨率高、便于检测特定组织特定细胞基因转录表达信息的空间转录组建库测序技术。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置：包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于(略大于即可)硅基寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um(例如为45～55μm，即，厚度为50μm左右)的组织冷冻切片，所述组织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤(即，略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片上所有探针覆盖的面积。作为本专利技术的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置的改进：所述硅基寡核苷酸芯片的锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC。本专利技术还同时提供利用上述任意一种装置进行的空间转录组测序技术方法，包括以下步骤：1)、首先加入第一段引物(20nmol)，第一段引物的序列为5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，退火温度为75度/70度；然后再加入第二段引物(约2ug的总量)，0.1μMPolyd(T)Primer5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN，退火温度从70降到15度；再加入T4连接酶(2ul)，用于连接第一段和第二段引物，维持温度15度，反应(快速反应)20min，反应完成后吸走多余液体；2)、将组织切片放置于盖玻片表面(加有位置标记的盖玻片表面)，组织切片的厚度为10～50um(原则以小于或约等于细胞厚度为准)，大小不超过1.5×1.5cm；将样品朝上的盖玻片放置于显微镜下观察组织细胞的位置，并拍照用于后续定位；完成拍照后，在芯片表面加入裂解液(10ul)，从而使裂解液铺满探针芯片探针表面；将盖玻片覆盖在芯片上，组织样品向下直接与芯片探针接触；盖玻片大小与芯片探针部分的大小对应，用于对应定位组织的部位；对芯片进行如下孵育，75℃---3min---65℃-0.1℃/s-(37～45)℃---取出；注意，75℃---3min打开TotalRNA的二级结构，准备和引物结合；0.1℃/s退火使引物与模版结合更加准确；根据结合区域长度设定一般为40℃，长度改变需调整，当oligoT数目在13-18个之间变化时，最终温度范围在37-40℃变化，OligoT增多时提高温度(例如至45℃)；取走盖玻片以及覆盖在芯片表面的组织样品，并吸走所有液体，使用RNasefree水轻柔洗涤一次；3)、在上述步骤2)完成后，在芯片上完成第一链反转录，然后消化RNA；即，消化1ulRNaseA(10mg/ml)(分解游离的RNA)；具体如下：降解剩余的RNA，然后95℃孵化10min，吸取所有液体，转移到离心管。芯片使用RNasefree水洗涤2次，并烘干可以重复使用。在PCR管里进行的反应：加入0.5ul酶RNaseH(60U/μl)(分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链)，37℃反应5min；备注：先RNaseA消化游离的单链RNA，同时95℃高温使杂交RNA解链，并且热打断RNA；然后RNaseH将退火结合回反转录第一链的小片段RNA降解；4)、在上述3)步骤结束后的消化体系里，进行第二链引物的结合；即，加入1μMSecondPrimer和1μMSecondREVPrimer从98℃---1min---80℃-0.2℃/s-25℃---30min，采用梯度孵化的方式结合反应；5)、将上述步骤4)孵化后的反应液里，接着进行第二链条延伸反应；即，分别加入9.5μlddH2O，4μl10×NEBuffer，2μl10mMdNTP和2μlKlenow(3’-5’exo-)，在预先设置成25℃PCR仪中延伸(PCR仪背景温度设为<25℃，温度太高会使第五步结合的引物脱落)；6)、将上述步骤5)反应完后，对产物进行磁珠纯化(先配制80％无水乙醇，总体积＝0.4*(n+1)ml，n＝样品数)；具体步骤可如下：1.加水补齐至80μl，加入80μlBECKBeads(1x)；2.充分混匀后(吸打至少10次)，静置5min；3.稍离心，至于磁珠板上；4.静置5min或看到液体澄清，缓慢吸取155μl上清，丢弃；5.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置3本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，其特征是：包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于硅基寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um的组织冷冻切片，所述组织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤硅基寡核苷酸芯片上所有探针覆盖的面积。

【技术特征摘要】
1.基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，其特征是：包括盖玻片
和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；
所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于硅基寡核苷酸芯片的面
积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um的组织冷冻切片，所述组
织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤硅基寡核苷酸芯片上所有
探针覆盖的面积。
2.根据权利要求1所述的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，
其特征是：所述硅基寡核苷酸芯片的锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGA
ACTCCAGTCACC。
3.根据权利要求2所述的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，
其特征是：包括如下2段引物：
第一段引物：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
第二段引物：5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN。
4.利用如权利要求1～3中任意一种装置进行的空间转录组测序技术方法，其特征是包
括以下步骤：
1)、首先加入第一段引物，第一段引物为5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，...

【专利技术属性】
技术研发人员：金谷雷，牛耀芳，
申请(专利权)人：杭州谷禾信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33